陳曉紅 鄭陸 朱一力 李青南 王宏梅

1 首都體育學(xué)院（北京 100088） 2 廣東藥學(xué)院

運(yùn)動(dòng)與骨代謝密切相關(guān)，其效應(yīng)表現(xiàn)為骨量（BMD、BMC）改變，以及在此基礎(chǔ)上的骨質(zhì)增強(qiáng)或減弱。人體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，長期大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)使女運(yùn)動(dòng)員出現(xiàn)月經(jīng)周期紊亂，骨密度降低[1-3]，甚至產(chǎn)生應(yīng)力性骨折[4，5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)使大鼠出現(xiàn)動(dòng)情周期抑制[6]，骨量下降[7]。但尚缺乏對于大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)及過量運(yùn)動(dòng)致骨量降低機(jī)制的研究。本研究通過測定遞增負(fù)荷大鼠脛骨上段骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)，從組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)水平闡釋過量負(fù)荷運(yùn)動(dòng)骨量降低的靜、動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)，及其可能機(jī)制，為豐富骨質(zhì)疏松的病理機(jī)制理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

3月齡未經(jīng)交配的雌性SD大鼠154只，體重269.51 ± 12.51 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，以國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物常規(guī)飼料喂養(yǎng)。環(huán)境溫度18～24℃，相對濕度45～55%，通風(fēng)良好。

1.2 動(dòng)物分組及訓(xùn)練方案

實(shí)驗(yàn)開始前所有大鼠進(jìn)行一周的適應(yīng)性訓(xùn)練，將進(jìn)行運(yùn)動(dòng)的大鼠分為8組，按照負(fù)荷設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)分別進(jìn)行2、4、6、8、9、11、13、15周的遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)，每組 10 只（T2、T4、T6、T8、T9、T11、T13、T15）。同期設(shè)立與運(yùn)動(dòng)組相對應(yīng)的對照組，每組8只（C2、C4、C6、C8、C9、C11、C13、C15）。10 只 3月齡大鼠設(shè)為基礎(chǔ)對照組（BC）。運(yùn)動(dòng)組大鼠采用杭州段氏PT2000型跑臺(tái)進(jìn)行訓(xùn)練，每周運(yùn)動(dòng)6天，休息1天。負(fù)荷設(shè)定參照Bedford[8]運(yùn)動(dòng)負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)和鄭陸等[6]建立的運(yùn)動(dòng)性動(dòng)情周期紊亂動(dòng)物模型的負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)。具體的負(fù)荷設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 大鼠運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的設(shè)定

1.3 骨骼前期處理及骨密度測定

按計(jì)劃將大鼠分批處死。處死前第13和14天腹部皮下各注射一次鹽酸四環(huán)素（25 mg/kg）；第3和4天頸部皮下各注射一次calcein（5 mg/kg）。大鼠以3%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉（30 mg/kg體重）。以雙能X線骨密度掃描儀（lunar prodigy）測量大鼠全身骨密度（bone mineral density，BMD）。大鼠處死后，取右側(cè)脛骨，剔除軟組織，進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測量。

1.4 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)制樣

用慢速骨鋸（Bushler LTD，USA）將大鼠脛骨鋸為3段，取脛骨近心端，沿脛骨粗隆行冠狀面切開，暴露骨髓腔。經(jīng)系列脫水、甲基丙烯酸甲酯不脫鈣骨包埋、硬組織切片機(jī)（LEICA RM2255）切片，以BIOQUENT圖像系統(tǒng)對骨切片進(jìn)行形態(tài)觀察和分析計(jì)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS for windows 11.0軟件處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean ± SD）表示，以Independent-sample t Test對運(yùn)動(dòng)組及對照組大鼠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；并以O(shè)ne-way ANOVA對大鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)進(jìn)行組間差異比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)P = 0.05，P < 0.05為差異顯著，P < 0.01為差異非常顯著。

2 結(jié)果

2.1 大鼠全身骨密度

表2顯示，大鼠骨密度隨年齡增加呈升高趨勢，在訓(xùn)練前半程各運(yùn)動(dòng)組（T2-9）骨密度亦有所增加，但T9-13各組骨密度值基本恒定，略低于同期對照組，但無顯著差異，至T15組顯著低于對照組（P <0.001）。

表2 大鼠骨密度變化（g/cm2）

2.2 脛骨上段松質(zhì)骨形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果

2.2.1 靜態(tài)參數(shù)

表3 各組大鼠脛骨上段松質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)比較

表3顯示，各對照組靜態(tài)參數(shù)%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp之間無顯著性差異。各運(yùn)動(dòng)組大鼠%Tb.Ar呈微弱上升后急劇下降趨勢，峰值出現(xiàn)在T11周，T13和T15組均與同期對照有顯著性差異。Tb.Th與%Tb.Ar趨勢一致。Tb.N則隨運(yùn)動(dòng)時(shí)間增加持續(xù)下降，T15組為最低點(diǎn)，和C15組比較有顯著性差異。BC至T11組Tb.Sp值基本持平，但T13組及T15組明顯上升，與同期對照組相比分別增加36.81%和75.65%，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2 動(dòng)態(tài)參數(shù)

表4顯示，各組大鼠脛骨上段動(dòng)態(tài)參數(shù)（%L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV）的變化見表4，BC至C15組大鼠的%L.Pm波動(dòng)較大，但各組間無顯著性差異；MAR漸趨下降，除C15與BC組之間有顯著性差異外，各對照組間無顯著性差異；BFR/BS和BFR/BV也呈波浪式下降，各組間亦無顯著性差異。

BC至T15各組%L.Pm的變化趨勢為先下降后上升，T11組降至最低點(diǎn)，并與同期對照組有顯著性差異。BC-T13各組的MAR持續(xù)下降，T13組最低（與BC相比下降33.10%），T15組略有回升，運(yùn)動(dòng)各組與同期對照組相比均無顯著性差異。BFR/BS、BFR/BV的變化趨勢較為一致，呈先下降后上升，T11組達(dá)最低點(diǎn)，T11和T15組的BFR/BV與同期對照相比有顯著性差異。

表4 各組大鼠脛骨上段松質(zhì)骨動(dòng)態(tài)參數(shù)比較

2.2.3 細(xì)胞參數(shù)

表5顯示，各對照組大鼠細(xì)胞參數(shù)Oc.N、Oc.Pm%隨月齡增加呈先降低后持平趨勢，C11組、C13組和C15組Oc.N、Oc.Pm%與BC組相比有顯著性差異；C4組Ob.N、Ob.Pm%在最高點(diǎn)，以后略下降。

BC組至T15組Oc.N、Oc.Pm%變化趨勢為先降后升，T11組達(dá)最低點(diǎn)并與同期對照組相比有顯著性差異。BC組至T11組Ob.N、Ob.Pm%大致持平，后明顯升高。

表5 各組大鼠脛骨上段松質(zhì)骨細(xì)胞參數(shù)比較

3 討論

3.1 長期遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對大鼠骨密度的影響

從各組大鼠BMD均值可以看出，BMD隨年齡增長呈波浪式上升趨勢，說明本研究所選大鼠處于骨量上升階段。3月齡大鼠骨量尚未達(dá)到峰值[9]，隨著月齡增加，大鼠骨量在7～10月齡逐漸達(dá)到最大值[10]。T2～T9組大鼠BMD雖有所增加，但與相應(yīng)對照組無顯著性差異。由于實(shí)驗(yàn)所用大鼠處于生長發(fā)育期，其BMD升高可能系增齡和運(yùn)動(dòng)負(fù)荷綜合作用的結(jié)果。這或許意味著前9周的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷對骨組織而言相對較低，對骨代謝的刺激效果較弱；另一種可能的解釋是，骨的重建過程相對較慢，運(yùn)動(dòng)所致骨量的變化亦需要較長時(shí)間方能顯現(xiàn)，9周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能尚不足以引起骨量改變。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練9周后，隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷增加，大鼠BMD呈下降趨勢，至T15組與同期對照組有顯著差異（P < 0.001）?？梢姶笫蠊橇吭鲩L受長時(shí)間大負(fù)荷過量運(yùn)動(dòng)影響而受到抑制，其原因除與運(yùn)動(dòng)負(fù)荷本身有關(guān)外，機(jī)體內(nèi)分泌紊亂、HPO軸受抑、雌激素水平低下等為重要原因[11]。

3.2 遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對大鼠脛骨上段松質(zhì)骨骨形態(tài)

計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響

3.2.1 遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對大鼠脛骨上段松質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)的影響

本實(shí)驗(yàn)中，各對照組大鼠%Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp無顯著性差異，其中%Tb.Ar最高點(diǎn)出現(xiàn)在5.5月齡左右，這與劉曉青等[12]的報(bào)道一致。由此可見，3～7月齡大鼠松質(zhì)骨骨小梁總面積及骨結(jié)構(gòu)變化不大，處于相對穩(wěn)定狀態(tài)。但同期結(jié)果顯示，大鼠全身BMD隨月齡增加有明顯增加趨勢，由此推測3～7月齡大鼠全身骨密度增加與松質(zhì)骨骨小梁結(jié)構(gòu)無關(guān)，可能來自于皮質(zhì)骨改變，或者與松質(zhì)骨中骨小梁鈣沉積量明顯增加有關(guān)。

各 運(yùn) 動(dòng) 組 大 鼠 %Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N和TB.Sp的變化趨勢不盡相同，但各指標(biāo)變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)基本出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)11周前后。截止運(yùn)動(dòng)11周，運(yùn)動(dòng)組大鼠%Tb.Ar和Tb.Th呈緩慢升高趨勢，Tb.N呈緩慢降低趨勢，Tb.Sp水平幾乎恒定，各指標(biāo)變化與同期對照組相比均無顯著差異?？梢?，前11周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對大鼠脛骨上段骨小梁產(chǎn)生正性刺激作用，使%Tb.Ar小幅增加，其增加原因可能與骨小梁厚度（Tb.Th）增加有關(guān)，換言之，前11周的運(yùn)動(dòng)使大鼠脛骨上段骨小梁增粗增大，而數(shù)量略下降，骨小梁結(jié)構(gòu)的這種變化特征可能是骨骼在運(yùn)動(dòng)負(fù)荷刺激下所產(chǎn)生的適應(yīng)性變化。而此時(shí)大鼠全身BMD緩慢升高并維持在較高水平，與%Tb.Ar和Tb.Th的增加一致。但這些指標(biāo)的增加幅度有限，其原因可能與這種閾值負(fù)荷下的良性刺激對大鼠骨骼的作用時(shí)間偏短（僅11周），效果尚未充分顯現(xiàn)有關(guān)。有理由推測，假若維持此運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，延長運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練周期，骨量可能會(huì)明顯增加。

T13組和T15組大鼠%Tb.Ar明顯下降，與同期對照相比分別下降33.2%和48.6%，有顯著性差異；同時(shí)，Tb.Th、Tb.N均下降，Tb.Sp急劇升高，并與同期對照比較差異顯著。此與Bourrin等[13]的研究結(jié)果一致。由此可見，在遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)下，T13組和T15組大鼠松質(zhì)骨數(shù)量和骨結(jié)構(gòu)陡然下降。于順祿等[14]認(rèn)為，無論何種原因造成的骨質(zhì)疏松，%Tb.Ar值如低于正常（或?qū)φ諛?biāo)準(zhǔn)）的15%，就應(yīng)視為骨質(zhì)疏松癥。故T13組和T15組大鼠已出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松。此外，T15組大鼠全身BMD亦顯著降低，說明持續(xù)的遞增負(fù)荷最終不僅導(dǎo)致大鼠松質(zhì)骨骨小梁面積減小、骨結(jié)構(gòu)變差，還使大鼠全身骨密度顯著降低，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性骨量降低。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛笫蟮墓墙M織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)與去卵巢骨質(zhì)疏松模型相似，大鼠去卵巢后，其松質(zhì)骨骨小梁面積、數(shù)量減少，骨小梁分離度上升[9，15]。本研究中，運(yùn)動(dòng)組大鼠全身BMD降低的時(shí)間明顯滯后于骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的變化，該結(jié)果與趙燁等[16]的研究一致，也進(jìn)一步證實(shí)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)技術(shù)作為一種先進(jìn)的骨代謝評價(jià)手段，其早期、靈敏等特點(diǎn)有助于發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)的早期變化。

3.2.2 遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對大鼠脛骨上段松質(zhì)骨動(dòng)態(tài)參數(shù)及細(xì)胞參數(shù)的影響

動(dòng)態(tài)參數(shù)反映骨表面礦化的量和速率，并可以解釋靜態(tài)參數(shù)變化的原因。本研究中，BC組至C15組大鼠%L.Pm呈先上升后下降趨勢，其中C4（4月齡）組最高，但各組間無顯著性差異；MAR、BFR/BS、BFR/BV均漸次降低，提示3～4月齡大鼠成骨細(xì)胞活性及骨形成率處于巔峰狀態(tài)，其原因是此階段大鼠脛骨上段的骨骺尚未閉合，血供和營養(yǎng)豐富，代謝功能活躍，骨的再生能力強(qiáng)，骨轉(zhuǎn)換率比較高[17]。隨著大鼠月齡的增加，其成骨活性及骨轉(zhuǎn)化率逐漸降低，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)最低點(diǎn)。同時(shí)，各對照組大鼠脛骨上段各項(xiàng)細(xì)胞參數(shù)亦發(fā)生相應(yīng)變化，3～4月齡大鼠Oc.N、Oc.Pm%及Ob.N、Ob.Pm%高于其他月齡組，說明此月齡大鼠成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞數(shù)量和活性處于較高水平，骨代謝轉(zhuǎn)化率較高。而后隨著鼠齡增加，成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞數(shù)量和活性逐漸降低，骨形成和骨吸收均逐漸放緩，骨代謝轉(zhuǎn)化率下降，此結(jié)果與上述動(dòng)態(tài)參數(shù)結(jié)果所表達(dá)的意義一致。結(jié)合脛骨上段靜態(tài)參數(shù)的變化可以發(fā)現(xiàn)，3～7月齡大鼠骨小梁形態(tài)和結(jié)構(gòu)基本維持不變，骨形成和骨吸收均減弱，并處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，骨量保持穩(wěn)定[9]。

分析各運(yùn)動(dòng)組動(dòng)態(tài)參數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，BC組至T15組%L.Pm、BFR/BS、BFR/BV的變化趨勢均為先下降后上升，T11組達(dá)最低點(diǎn)；MAR呈持續(xù)下降趨勢，T13組達(dá)最低點(diǎn)，T15組略有回升。這表明動(dòng)態(tài)參數(shù)變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)亦大致出現(xiàn)在T11組。BC組至T11組 的%L.Pm、MAR、BFR/BS、BFR/BV均 呈下降趨勢，說明大鼠脛骨上段成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性逐漸降低，骨形成和骨吸收同步受到抑制，骨代謝轉(zhuǎn)化率逐漸下降。值得注意的是，在整個(gè)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練期間，運(yùn)動(dòng)組MAR與同期對照組比較無顯著性差異，由于礦化沉積率代表每天骨表面礦化的寬度，反映骨礦化的快慢，故推測在整個(gè)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練期間，大鼠骨表面成骨細(xì)胞的礦化并未發(fā)生明顯變化。而各運(yùn)動(dòng)組Oc.N、Oc.Pm%及Ob.N、Ob.Pm%也逐漸下降，這從細(xì)胞水平證實(shí)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前11周大鼠破骨細(xì)胞骨吸收和成骨細(xì)胞骨形成均受到一定程度的抑制。但分析BC組至T11組靜態(tài)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，前11周的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對骨小梁面積和結(jié)構(gòu)略有正性刺激作用，使骨結(jié)構(gòu)更趨合理，骨量增加。而在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的后半程（11～15周），代表骨形成的參數(shù)（%L.Pm、BFR/BS、BFR/BV、Ob.N、Ob.Pm%）和代表骨吸收的參數(shù)（Oc.N、Oc.Pm%）均有明顯回升，但代表骨小梁數(shù)量和結(jié)構(gòu)的靜態(tài)參數(shù)（骨小梁面積百分比、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目、骨小梁分離度）出現(xiàn)負(fù)性改變，表明隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加，大鼠的骨吸收和骨形成均明顯增加，骨轉(zhuǎn)化率增加，骨吸收大于骨形成，骨量下降。這種特點(diǎn)與絕經(jīng)期婦女的骨代謝狀態(tài)相似[15，18]，絕經(jīng)后婦女有大量的骨重建單位參與骨的更新，骨更新率明顯加速，新骨形成速度比骨吸收慢，造成骨量快速、大量丟失。

綜上所述，15周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使大鼠全身BMD降低，脛骨上段骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)亦發(fā)生明顯變化，骨形成參數(shù)（%L.Pm、BFR/BS、BFR/BV、Ob.N、Ob.Pm%）和骨吸收的參數(shù)（Oc.N、Oc.Pm%）均呈現(xiàn)先下降后上升的“V”形變化，T11組達(dá)最低點(diǎn)，表明在遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)11～15周，大鼠骨形成和骨吸收均加速；脛骨上段松質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù)亦發(fā)生明顯變化，骨小梁面積、數(shù)量及寬度均顯著下降，骨小梁分離度明顯升高，表明本研究的遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)使骨代謝呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)換狀態(tài)，且骨吸收大于骨形成，骨量下降。這種變化的可能機(jī)制為：大負(fù)荷運(yùn)動(dòng)抑制大鼠HPO軸[19]，降低卵巢激素水平[11]，出現(xiàn)類似于人類絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的骨代謝特征——骨形成和骨吸收均增強(qiáng)，骨吸收占主導(dǎo)地位，骨代謝狀態(tài)為高轉(zhuǎn)換型。

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