周義義 傅博 朱榮 溫州大學(xué)體育學(xué)院（溫州 505） 遼寧省足球運(yùn)動(dòng)管理中心 溫州醫(yī)學(xué)院

大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可造成運(yùn)動(dòng)性免疫抑制，與運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡有關(guān)［1-3］。近年來，關(guān)于運(yùn)動(dòng)與免疫細(xì)胞凋亡的研究主要集中在不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對淋巴細(xì)胞凋亡的影響。研究表明，劇烈運(yùn)動(dòng)或力竭運(yùn)動(dòng)可顯著誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡和DNA損傷［4］，而中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)（65%～70%VO2max）對淋巴細(xì)胞凋亡的影響仍有爭議［5-7］。肌肉劇烈收縮易造成運(yùn)動(dòng)性肌肉損傷、延遲性肌肉酸痛和運(yùn)動(dòng)性疲勞［8］，也是造成運(yùn)動(dòng)性免疫抑制的重要誘因［9］，但機(jī)制未明。本研究以負(fù)重運(yùn)動(dòng)造成肌肉損傷為模型［10］，探討其對外周血淋巴細(xì)胞凋亡的影響并分析可能機(jī)制。

1 對象與方法

1.1 研究對象

16名溫州體育運(yùn)動(dòng)學(xué)校的男子田徑運(yùn)動(dòng)員（二級）自愿參加本實(shí)驗(yàn)，年齡（14.5±1.4）歲，身高（1.75±0.12）m，體重（67.8±4.6）kg，訓(xùn)練年限（4.8±0.7）年。所有運(yùn)動(dòng)員身體健康，無心血管疾病、急慢性感染、骨關(guān)節(jié)疾病及其他疾病史，近期無服藥史，無吸煙、飲酒等不良嗜好。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案與取血

受試者在實(shí)驗(yàn)前72 h內(nèi)均無劇烈運(yùn)動(dòng)，實(shí)驗(yàn)前一晚至少睡眠8 h。清晨空腹肘正中靜脈采血5 ml后休息15 min，然后進(jìn)行一次急性負(fù)重離心運(yùn)動(dòng)。方案如下［10］：受試者采用背包負(fù)重，重量為各自體重的30%，先進(jìn)行5 min臺階試驗(yàn)（臺階高30 cm，登階頻率為54步/min，用節(jié)拍器控制），緊接著完成15次蹲起，3 s蹲下，2 s站起（延長離心收縮時(shí)間）。運(yùn)動(dòng)后即刻和運(yùn)動(dòng)后2 h、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h靜脈采血5 ml，EDTA抗凝。

1.3 血清CK和皮質(zhì)醇

取抗凝血離心分離血清，使用試劑盒（南京建成生物工程研究所）并嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行。測試儀器：血清CK使用MD-100半自動(dòng)生化分析儀（美國伯明斯頓公司）測定，血清皮質(zhì)醇使用FMQ-9013C型γ放免分析儀（唐山市晨曦電子有限公司）測定。

1.4 淋巴細(xì)胞的分離

取新鮮肝素鈉抗凝血3 ml，加入0.375 ml淋巴細(xì)胞分離液，混勻，800g室溫離心30 min，取出白色絨毛狀的淋巴細(xì)胞層，即外周血單個(gè)核細(xì)胞，用RPMI1640液洗滌，400g離心10 min，棄上清，用含10% 胎牛血清的RPMI1640液重懸細(xì)胞，置入培養(yǎng)皿，調(diào)細(xì)胞密度5×108～1×109/L。利用單核細(xì)胞貼壁特性，取非貼壁細(xì)胞懸液少許，經(jīng)瑞氏染色后油鏡下檢測形態(tài)，證實(shí)為淋巴細(xì)胞。

1.5 淋巴細(xì)胞凋亡率

用冷PBS調(diào)至淋巴細(xì)胞為5×108~1×109/L，加入0.8 ml含RNase的碘化丙啶（PI），4℃避光15 min。FACS 420流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測淋巴細(xì)胞凋亡率。

1.6 淋巴細(xì)胞Bax/Bcl-2和Fas/FasL的表達(dá)

淋巴細(xì)胞裂解后用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)移于PVDF膜。一抗（美國Santacruz公司）孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗（天津TBD公司）孵育1小時(shí)，ECL顯影。采用凝膠系統(tǒng)分析軟件掃描各條帶灰度值，以對照組運(yùn)動(dòng)前條帶為100%，其它各條帶與其比值，即其相對表達(dá)量（%），actin為內(nèi)參蛋白。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組比較采用單因素方差分析，P < 0.05為顯著性水平，P < 0.01為非常顯著水平。

2 結(jié)果

表1顯示，淋巴細(xì)胞凋亡率在運(yùn)動(dòng)后呈先上升后下降的變化趨勢，運(yùn)動(dòng)后24 h達(dá)峰值，其中運(yùn)動(dòng)后即刻和運(yùn)動(dòng)后2 h、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h均較運(yùn)動(dòng)前顯著性升高（均為P < 0.01），運(yùn)動(dòng)后48 h較運(yùn)動(dòng)后24 h顯著性下降（P < 0.01）；血清CK和Bax/Bcl-2亦呈先升高后下降的并行性變化趨勢，其中運(yùn)動(dòng)后12 h、24 h和48 h均較運(yùn)動(dòng)前顯著性升高（均為P < 0.01），運(yùn)動(dòng)后24 h達(dá)峰值，運(yùn)動(dòng)后48 h較運(yùn)動(dòng)后24 h顯著性下降（P < 0.01；P < 0.05）；Fas/FasL在各時(shí)間點(diǎn)均無顯著性變化（P> 0.05）；血清皮質(zhì)醇在運(yùn)動(dòng)后即刻、運(yùn)動(dòng)后2 h、4 h、8 h、12 h均較運(yùn)動(dòng)前顯著性升高（均為P < 0.01），運(yùn)動(dòng)后12 h達(dá)峰值，運(yùn)動(dòng)后24 h恢復(fù)至運(yùn)動(dòng)前水平（P > 0.05）。

表1 淋巴細(xì)胞凋亡率、血清CK、皮質(zhì)醇、Fas/FasL、Bax/Bcl-2的時(shí)程變化

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，一次急性負(fù)重運(yùn)動(dòng)后外周血淋巴細(xì)胞凋亡率在運(yùn)動(dòng)后即刻開始升高，24 h達(dá)峰值，48 h開始下降但仍高于運(yùn)動(dòng)前水平。Tuan等［11］發(fā)現(xiàn)，30 min大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后淋巴細(xì)胞凋亡率顯著升高并一直持續(xù)到運(yùn)動(dòng)后72 h，與本研究的結(jié)果相似。這提示大強(qiáng)度不習(xí)慣的離心運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡增加并持續(xù)數(shù)天，因此可能是運(yùn)動(dòng)性免疫抑制發(fā)生的原因之一。

肌肉進(jìn)行大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)（特別是離心運(yùn)動(dòng)）易發(fā)生運(yùn)動(dòng)性肌肉損傷，可能與肌細(xì)胞受到強(qiáng)烈的機(jī)械牽拉以及胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化有關(guān)［12］。肌細(xì)胞的機(jī)械牽拉（機(jī)械性損傷）可使Z盤斷裂、肌節(jié)降解，局部組織損傷以及膜通透性增高；劇烈運(yùn)動(dòng)造成肌細(xì)胞的能量耗竭（代謝性損傷），胞內(nèi)鈣離子濃度升高并激活鈣依賴的蛋白激酶，破壞骨架蛋白（肌節(jié)），同時(shí)激活鉀離子通道使膜電阻下降，通透性增高。肌肉損傷后，細(xì)胞內(nèi)容物透過肌膜漏出入血，造成血中非功能蛋白升高，其中血清CK是肌肉損傷的特異標(biāo)志物［13］。本研究以負(fù)重運(yùn)動(dòng)為干預(yù)模型，其肌肉收縮的方式以離心運(yùn)動(dòng)為主（也包括向心運(yùn)動(dòng)），運(yùn)動(dòng)后12 h血清CK顯著升高，24 h達(dá)峰值，48 h開始下降，但仍高于運(yùn)動(dòng)前，這與Heled等［10］的研究結(jié)果一致，提示一次急性負(fù)重運(yùn)動(dòng)造成的肌肉損傷可持續(xù)2～3天，并發(fā)生肌纖維降解現(xiàn)象［14］。研究表明，運(yùn)動(dòng)后數(shù)天發(fā)生的繼發(fā)性肌肉降解可能與單核細(xì)胞釋放自由基有關(guān)［15］。肌肉進(jìn)行急性運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生大量自由基，不僅與運(yùn)動(dòng)時(shí)細(xì)胞的無氧代謝有關(guān)，而且與免疫細(xì)胞的吞噬作用造成的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)關(guān)系密切［15］。此外，損傷的肌細(xì)胞內(nèi)容物外漏入血并刺激循環(huán)中的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生自由基的增多（氧化應(yīng)激），進(jìn)而導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡增加［15，16］。結(jié)合本研究中CK與淋巴細(xì)胞凋亡率的變化，推測一次急性負(fù)重運(yùn)動(dòng)后12～24 h肌肉產(chǎn)生的損傷性變化參與了對該時(shí)期淋巴細(xì)胞凋亡的調(diào)控。

細(xì)胞凋亡的途徑包括死亡受體介導(dǎo)的信號通路和線粒體介導(dǎo)的信號通路。死亡受體介導(dǎo)的信號通路是通過Fas和Fas配體（FasL）結(jié)合而啟動(dòng)凋亡［17］。Ostrowski等［18］的研究指出，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致肌肉釋放促炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等，可引發(fā)死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號通路。由于本研究中Fas和FasL在各時(shí)間點(diǎn)均無變化，因此不支持上述結(jié)論，可能與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ\(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間等）有關(guān)。線粒體介導(dǎo)的信號通路是通過Bcl-2超家族蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的［19］。Bax是促凋亡因子，在體內(nèi)形成同二聚體，改變線粒體膜電位，增加線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，促進(jìn)細(xì)胞色素C等物質(zhì)進(jìn)入胞漿，激活Caspase，引起細(xì)胞凋亡［20］；而Bcl-2表達(dá)上調(diào)可使細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）增加［21］，清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷并抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生［22］。因此，Bcl-2和Bax是通過改變氧化應(yīng)激水平調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的［23］。研究表明，單獨(dú)Bax或Bcl-2的變化并不能完全代表細(xì)胞凋亡命運(yùn)，Simon等［24］的研究證實(shí)，Bax/Bcl-2比值的變化決定了細(xì)胞凋亡或存活。在本研究中，Bax/Bcl-2在運(yùn)動(dòng)后12 h顯著升高，24 h達(dá)峰值，48 h仍高于運(yùn)動(dòng)前水平，說明負(fù)重運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡主要是通過線粒體介導(dǎo)的信號途徑實(shí)現(xiàn)的。另外，Bax/Bcl-2的變化與血清CK基本一致，進(jìn)一步提示負(fù)重運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的肌肉損傷可能參與了外周血淋巴細(xì)胞凋亡的增加。研究表明，損傷的肌細(xì)胞內(nèi)容物外漏入血并刺激循環(huán)中的吞噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS和活性氮［25］，此外，運(yùn)動(dòng)時(shí)肌肉產(chǎn)生的ROS隨著肌肉損傷而釋放入血［26］。自由基的增多（氧化應(yīng)激）啟動(dòng)了胞漿的信號鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，導(dǎo)致p53蛋白磷酸化，從而升高Bax并降低Bcl-2［27］，改變了細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白之間的穩(wěn)態(tài)平衡，破壞線粒體膜電位和DNA結(jié)構(gòu)，引發(fā)線粒體介導(dǎo)的凋亡信號通路［28］。

本研究中，淋巴細(xì)胞凋亡率在運(yùn)動(dòng)后即刻至運(yùn)動(dòng)后48 h均顯著升高，而血清CK和Bax/Bcl-2在運(yùn)動(dòng)后12 h才顯著升高，提示其他因素參與了淋巴細(xì)胞的早期凋亡。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，皮質(zhì)醇（糖皮質(zhì)激素）可誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞凋亡［29］。本研究發(fā)現(xiàn)，血清皮質(zhì)醇在一次急性負(fù)重運(yùn)動(dòng)后即刻顯著升高，12 h達(dá)峰值，24～48 h恢復(fù)至運(yùn)動(dòng)前水平，這與Kruger等［30］的最新研究一致，他們發(fā)現(xiàn)，一次大強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練后血清皮質(zhì)醇顯著升高，24 h恢復(fù)，并證實(shí)大強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡是通過糖皮質(zhì)激素受體途徑介導(dǎo)的。因此，本研究的結(jié)果提示，皮質(zhì)醇的升高參與了負(fù)重運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞早期凋亡。

4 總結(jié)

負(fù)重運(yùn)動(dòng)可誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與運(yùn)動(dòng)性肌肉損傷、應(yīng)激激素（皮質(zhì)醇）升高和線粒體氧化應(yīng)激有關(guān)。

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