楊馥如，于 海，王 斌，黃 夢，馬繼紅，周艷君，童光志

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

H1亞型豬流感(swine influenza, SI)是由隸屬于正粘病毒科A型流感病毒屬的豬流感病毒( Swine influenza virus, SIV)引起的豬呼吸道疾病，是目前危害全世界養(yǎng)豬業(yè)的重要呼吸道疾病之一[1]。1930年，Shope等[2]首次分離到SIV，后經(jīng)研究證實，該毒株屬于經(jīng)典H1N1亞型SIV?；仡櫄v史上的大型流感爆發(fā)，經(jīng)典H1N1亞型SIV曾在加拿大、巴西、香港、日本、印度、中國、肯尼亞、伊朗等各地被廣泛報道[3]。1977年爆發(fā)的“俄國流感”也是由H1N1亞型流感病毒引起[4]。1998年以前，H1N1亞型SIV一直是北美豬群中流感病毒的優(yōu)勢毒株。歐洲大陸自1979年起開始廣泛流行經(jīng)典H1N1亞型SIV，血清陽性率達到20%～25%[5]。2009年，墨西哥和北美爆發(fā)了甲型H1N1流感，并迅速在世界范圍內(nèi)引發(fā)人類流感大流行。因此H1亞型SI作為一種具有嚴重危害的流行性疾病，對其進行研究具有重要的經(jīng)濟和公共衛(wèi)生學(xué)意義。

接種疫苗是預(yù)防流感發(fā)生與傳播的最有效方式，其中DNA疫苗可同時誘導(dǎo)細胞免疫和體液免疫而產(chǎn)生長期保護效果, 并且具有高度的安全穩(wěn)定性。目前豬流感病毒血凝素(Hemagglutinin, HA)的DNA 疫苗的研究已經(jīng)取得了一定的進展[6,7]，但是DNA疫苗存在體內(nèi)抗原表達量低的缺點，因此，提高DNA疫苗的免疫原性已成為基因免疫的熱點。對免疫原基因進行密碼子優(yōu)化，使其為哺乳動物體內(nèi)偏嗜性密碼子，可導(dǎo)致mRNA中CG含量的大幅度提高，從而增加mRNA的穩(wěn)定性，最終可使蛋白表達量大大提高。密碼子優(yōu)化成功的例子已有很多報道[8-11]。本研究對 H1亞型豬流感病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)HA基因密碼子進行優(yōu)化，與野生型A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)HA基因分別構(gòu)建免疫質(zhì)粒，并通過免疫小鼠評價疫苗的免疫原性和保護效力，為進一步研究和開發(fā)H1亞型豬流感病毒的HA基因DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株、細胞與載體 豬流感病毒毒株A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)由本實驗室分離鑒定保存；質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌E.coliDH5α和PCAGGS原核表達載體為本實驗室保存。

1.1.2 主 要 試 劑 ExTaq DNA聚 合 酶、SmalⅠ和XhoⅠ 限 制 性 內(nèi) 切 酶、RNase Inhibitor、AMV Reverse Transcriptase、dNTPs和 T4 DNA連接酶購自寶生物工程有限公司；預(yù)染蛋白Marker購自NEB公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自上海華舜生物工程公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；DMEM細胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自中杉金橋公司；鼠抗A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)陽性血清由本實驗室制備保存；細胞因子(IL-4 和IFN-γ)檢測試劑盒購自R&D Systems公司；RNA提取試劑盒購于Qiagen公司；其他普通生化試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 實驗動物 9～11日齡SPF雞胚由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供；6～8周齡雌性BALB/c小鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1HA基因密碼子優(yōu)化 將A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)的HA基因全部密碼子按豬體所偏嗜的密碼子進行優(yōu)化，并在該基因上引入SmalⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點，命名為optiHA，基因的優(yōu)化及改造由英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.2HA基因的擴增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)野生型HA基因和optiHA基因分別進行PCR擴增，經(jīng)SmalⅠ和XhoⅠ雙酶切后與同樣酶切處理的載體PCAGGS連接，經(jīng)酶切、測序鑒定后得到的重組質(zhì)粒分別命名為PCAGGS-HA和PCAGGS-optiHA。

1.2.3 間接免疫熒光檢測重組質(zhì)粒的體外表達 將4 μg重組質(zhì)粒PCAGGS-HA和PCAGGS-optiHA分別在LipofectamineTM2000的介導(dǎo)下，體外轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)良好的293T 細胞，以空載體PCAGGS為對照。48 h后棄掉細胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的1×PBS重懸細胞后離心，重復(fù)2次。最后1次重懸的細胞鋪于載玻片上，自然干燥后用預(yù)冷的丙酮溶液4℃固定30min，加入鼠抗A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)陽性血清(1:500稀釋)，37℃作用1 h。用預(yù)冷的1×PBS洗3遍,加入熒光素標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1:10 000稀釋），37℃作用1 h。同樣用預(yù)冷的1×PBS洗3遍后，加20 μL甘油并蓋蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 免疫BALB/c 小鼠及攻毒試驗 選取6～8 周齡健康雌性BALB/c 小鼠30只，隨機分為3 組。重組質(zhì)粒PCAGGS-HA、PCAGGS-optiHA以及對照空載體pCAGGS分別以100 μg多點注射后腿肌肉。共免疫3 次，每次間隔3 周。在第1次免疫后第2、4、6 、8 周采血，分離血清用于檢測抗體。在3免后2周，通過滴鼻方式對每只小鼠感染50 μL 103.87EID50的A/Swine/A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)，攻毒后3 d安樂處死小鼠，取其肺部組織研磨，進行病毒的分離和滴定。

1.2.5 抗HA 特異性抗體和HI 抗體檢測 用終點稀釋間接ELISA 方法檢測抗HA 特異性抗體[12]。包被抗原用純化的A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)，封閉用5 %的脫脂乳，待檢血清用PBS 從100倍起做倍比稀釋，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠的IgG以 1:10 000稀釋，底物緩沖液避光顯色5 min， 2 mol/L H2SO4 終止反應(yīng)后， 酶標(biāo)儀測定OD450值。樣品血清的OD 值是對照血清的2 倍以上判為陽性。將每組收集的第8周血清用于檢測HI 抗體[13]。

1.2.6 細胞因子(IL-4 和IFN-γ)的檢測 IL-4 和IFN-γ的檢測按試劑盒說明書進行。每孔先加50 μL的Assay diluent，再分別加入50 μL 標(biāo)準(zhǔn)、對照和已做3倍稀釋的第8 周血清，37 ℃孵育2 h；洗板4 次，加入Conjugate工作液，37 ℃孵育2 h；洗板4次，加入100 μL Substrate solution工作液， 37 ℃避光孵育30 min，再加入100 μL Stop Solution，酶標(biāo)儀測定OD450值。

1.2.7 攻毒后肺病毒含量測定 在攻毒后d 3 安樂處死小鼠，取其肺部組織進行研磨，采用雞胚滴定EID50檢測肺臟中的病毒滴度。取組織勻漿上清進行10倍倍比稀釋，每個稀釋度接種5枚9～11日齡的SPF雞胚，37℃孵育48 h，通過血凝試驗判斷尿囊液中是否含有病毒。利用Reed-Muench法[14]計算肺臟中的病毒滴度，結(jié)果以log10EID50/mL±S.D表示。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)野生型HA基因和optiHA基因經(jīng)PCR擴增，分別與載體PCAGGS連接，經(jīng)SmalⅠ和XhoⅠ雙酶切和測序鑒定，獲得的片段大小約為1800 bp，同預(yù)期結(jié)果一致 (見圖1) 。

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定Fig.1 Construction and identif i cation of the recombinant expression plasmid

2.2 間接免疫熒光檢測 將重組質(zhì)粒PCAGGSHA、PCAGGS-optiHA和PCAGGS分別轉(zhuǎn)染293T細胞，48 h后收細胞并重懸，制細胞涂片，于熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，經(jīng)PCAGGS-optiHA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生熒光的細胞數(shù)明顯多于PCAGGS-HA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生熒光的細胞數(shù)，而空載體PCAGGS轉(zhuǎn)染未產(chǎn)生有熒光的細胞 (見圖2) 。

圖2 PCAGGS-HA、PCAGGS-optiHA和PCAGGS在293T 細胞上的表達（×400）Fig.2 Expression in the 293T cells of PCAGGS-HA、PCAGGS-optiHA and PCAGGS(×400)

2.3抗HA 特異性抗體和HI抗體的檢測 用ELISA檢測抗HA 特異性抗體，結(jié)果顯示在一免后2周免疫組PCAGGS-optiHA和PCAGGS-HA都產(chǎn)生了抗體，抗體水平相對不高并且差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，同時對照PCAGGS組沒有明顯的抗體產(chǎn)生。一免后的4、6、8周免疫組PCAGGS-optiHA的抗HA特異性抗體都明顯高于免疫組PCAGGS-HA，同時對照PCAGGS組一直未檢測到明顯的抗體產(chǎn)生（見圖3）。將每組收集的第8 周血清通過血凝抑制實驗檢測HI 抗體，結(jié)果表明免疫組PCAGGS-optiHA和PCAGGS-HA都可以檢測到抗體，而對照組PCAGGS基本檢測不到抗體，并且免疫組PCAGGS-optiHA的抗體效價要明顯高于免疫組PCAGGS-HA（P＜0.001，見表1）。

圖3 小鼠血清中抗HA特異性抗體的ELISA 檢測Fig.3 ELISA detection for anti-HA antibody in mice after inoculation of various plasmids

表1 小鼠血清中HI抗體檢測（P＜0.001）Table 1 HI antibody detection in mice after inoculation of various plasmids(P＜0.001)

2.4 細胞因子(IL-4和IFN-γ)的檢測 將首免后第8周的各組血清按照試劑盒的說明進行細胞因子檢測。結(jié)果顯示，質(zhì)粒PCAGGS-optiHA誘導(dǎo)了高水平的IL-4，而質(zhì)粒PCAGGS-HA誘導(dǎo)了較低水平的IL-4（P＜0.01，見圖5）。結(jié)果表明，質(zhì)粒PCAGGS-optiHA顯著地增強了IL-4 的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)了高水平的體液免疫應(yīng)答。而在檢測IFN-γ的實驗中，相對于質(zhì)粒PCAGGS-HA，質(zhì)粒PCAGGS-optiHA誘導(dǎo)產(chǎn)生了較高水平的IFN-γ（P＜0.05，見圖5）。結(jié)果表明，質(zhì)粒PCAGGS-optiHA顯著地增強了IFN-γ的產(chǎn)生，并能誘導(dǎo)較高水平的細胞免疫應(yīng)答。

圖5 細胞因子IL-4和IFN-γ 的檢測Fig.5 Level of IL-4 and IFN-γ from serum in the immunized mice

2.5 肺組織病毒含量檢測 在攻毒3 d后安樂處死小鼠，取其肺部組織進行研磨，取上清按 VI法測定病毒含量，并利用Reed-Muench法[14]計算肺臟中的病毒滴度，結(jié)果以log10EID50/mL表示，當(dāng)值小于1則表明檢測不到病毒。結(jié)果顯示，免疫組PCAGGS-HA小鼠肺臟中僅檢測到少量的病毒，免疫組PCAGGS-optiHA檢測不到病毒，而對照組PCAGGS小鼠肺中檢測到大量的病毒?？梢姡庖呓MPCAGGS-optiHA可有效阻止病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)在小鼠肺臟的復(fù)制。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，免疫組與對照組小鼠肺臟病毒滴度差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.01，見圖6）。

圖6 攻毒后d3小鼠肺臟中病毒滴度（P ＜ 0.01）Fig.6 Virus titers in lungs on day 3 after challenge(P ＜ 0.01)

3 討論

DNA疫苗的抗原表達水平對其免疫原性和保護效力起著十分關(guān)鍵的作用[15]，豬流感DNA疫苗的研制方法主要通過將豬流感病毒的免疫原HA或NA等基因單獨或與細胞因子編碼基因串聯(lián)到真核表達質(zhì)粒中，然后再將重組的質(zhì)粒DNA注入到機體內(nèi)，從而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答而發(fā)揮作用。Wong等[16]用脂質(zhì)體pCI作為載體來表達A/PR/8/34毒株的HA基因作為DNA疫苗。Ljungberg等[17]用2株在遺傳學(xué)和血清學(xué)不同的A型流感毒株(pKCMV HA A/Stockholm/7/97 and pKCMV HA A/NL/18/94)構(gòu)建嵌合HA質(zhì)粒DNA疫苗。胡永浩等[18]應(yīng)用已構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒pCI-H1-HA、pCAGGS-H1-HA、pCI-H3-HA和pCAGGS-H3-HA作 為DNA疫苗，經(jīng)動物實驗證明都可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體滴度[19]，但是DNA疫苗存在多次免疫才能誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，并且對大動物免疫效力低下等問題[20]。有研究表明，用經(jīng)過密碼子優(yōu)化的DNA疫苗接種模型動物，所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答會顯著提高。王俊國等[21]對H5亞型禽流感病毒A/Duck/Anhui/1/2006 (Clade 2.3)HA基因密碼子進行優(yōu)化，可以產(chǎn)生較強的免疫保護效力。侯艷紅等[22]研究的PRRSVGP5密碼子優(yōu)化的基因DNA疫苗在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了較強的免疫應(yīng)答。因此，本研究將H1亞型豬流感病毒A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)的HA基因的密碼子優(yōu)化為豬體內(nèi)偏嗜性密碼子optiHA，同野生型A/Swine/Guangdong/1/01(H1N1)的HA基因分別與真核表達載體PCAGGS相連構(gòu)成重組質(zhì)粒PCAGGS-optiHA和PCAGGS-HA。用間接免疫熒光技術(shù)檢測HA基因的體外表達時發(fā)現(xiàn)，PCAGGS-optiHA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生熒光的細胞數(shù)明顯多于PCAGGS-HA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生熒光的細胞數(shù)，這表明密碼子優(yōu)化的HA基因的蛋白表達水平要高于野生型的HA基因。免疫小鼠后，用ELISA檢測抗HA特異性抗體和血凝抑制檢測HI抗體，發(fā)現(xiàn)在首免第2周后，PCAGGS-optiHA免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生的HA特異性抗體和HI抗體滴度明顯高于PCAGGS-HA免疫組，這表明密碼子優(yōu)化的HA基因DNA疫苗的免疫原性要明顯高于野生型的HA基因DNA疫苗。細胞因子IL-4檢測實驗發(fā)現(xiàn)，兩免疫組都顯著高于對照組，這說明DNA免疫質(zhì)粒確實在一定程度上激活了機體的體液免疫應(yīng)答。同時，相對于PCAGGS-HA免疫組，PCAGGS-optiHA免疫組可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IL-4，說明免疫原基因密碼子優(yōu)化后誘發(fā)了較強的體液免疫應(yīng)答。細胞因子ILN-γ檢測實驗發(fā)現(xiàn)，雖然各組的值相對于IL-4的值較低，但同對照組相比，免疫組明顯可誘導(dǎo)產(chǎn)生比較高水平的ILN-γ，這一結(jié)論同細胞因子IL-4檢測相一致。攻毒實驗結(jié)果顯示，免疫組PCAGGSHA的肺組織病毒含量相對于空載體PCAGGS組有明顯降低，而免疫組PCAGGS-optiHA檢測不到病毒，這表明密碼子優(yōu)化的DNA疫苗可有效阻止病毒在小鼠肺臟的復(fù)制。

本研究結(jié)果表明，HA基因密碼子的優(yōu)化可顯著提高DNA疫苗的免疫原性，并且可增強誘導(dǎo)保護性體液免疫和細胞免疫應(yīng)答水平，這一結(jié)論為研究高效、安全新型的豬流感基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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