周春景，羅 榮，石耀軍，丁 碩,2，楊德浩,3 ，程國鋒

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實驗室，上海 200241；2.上海大學(xué)，上海 200444；3.河北北方學(xué)院，石家莊 075000）

Akt又稱蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)，在哺乳動物中，不同的Akt亞型都含有氨基末端PH結(jié)構(gòu)域，富含甘氨酸的鉸鏈區(qū)，中心激酶結(jié)構(gòu)域和富含色氨酸/蘇氨酸的羧基末端區(qū)組成[1,2]。

Akt通過磷酸化其下游蛋白分子，可調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育、凋亡和增殖等多種生物行為[3]。早在十多年前，研究表明Akt通路過度活化是腫瘤發(fā)生的一個重要因素[2-5]。另有研究表明，Akt蛋白可以促進(jìn)血管的形成，加速局部血液循環(huán)組織的重建，提高器官移植的存活率[6]。還有研究表明，Akt通過磷酸化GSK-3調(diào)節(jié)糖原的代謝[7,8]，另外，磷酸化的GSK-3可參與多種信號通路的調(diào)控[9]，比如WNT等。本研究對日本血吸蟲編碼Akt蛋白的cDNA進(jìn)行了初步研究，并制備了針對其的特異性抗體，為深入研究其功能奠定了初步基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料 新西蘭大耳兔購自上海羅涇飛達(dá)實驗動物養(yǎng)殖場；日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供。新西蘭大耳兔以腹部貼片法感染約4000條日本血吸蟲尾蚴，在感染尾蚴21 d后剖殺兔子，通過肝門靜脈灌注法收集血吸蟲蟲體，PBS充分洗滌蟲體以去除粘附物，液氮凍存待用。原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+) 和大腸桿菌BL21由本實驗室保存。

1.1.2 生化試劑 ExTaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶等購自TaKaRa生物工程 (大連) 有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III及預(yù)染蛋白質(zhì)Maker SM6071購自Fermentas公司； AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit 購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限 公 司；His-Bind?Purification Kit購 自 Novagen公司；DNA Marker DL2000、DNA Marker Ⅳ、預(yù)染蛋白質(zhì)MarkerⅡ購自天根生化科技（北京）有限公司；硝酸纖維素膜(Whatman)購自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司；羊抗兔IgG-AP及AP底物顯色液購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；TRIzol? reagent購自上海英駿生物技術(shù)公司。

1.1.3 引物合成和DNA測序 引物合成在上海杰瑞生物工程公司合成；重組質(zhì)粒DNA測序由華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 根據(jù)Akt蛋白的3個保守結(jié)構(gòu)域，利用在線工具Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析日本血吸蟲Akt的cDNA序列， 利 用 iprscan（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）分析蛋白結(jié)構(gòu)域，運(yùn)用ClustalW進(jìn)行多序列比對，并通過MEGA 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。1.2.2 日本血吸蟲cDNA制備 TRIzol?法抽提日本血吸蟲總RNA，DNase處理總RNA消除基因組，通過EB染色瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量并用分光光度計對其進(jìn)行濃度測定，采用Fermentas RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，制備日本血吸蟲cDNA。

1.2.3 重組質(zhì)粒pET28a(+)-SjAkt構(gòu)建 以制備的日本血吸蟲cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增（上游引物序列：5'-CGGAATTCGGTGCTGAAATTACAC TGGC-3'；下游引物序列: 5'-CCCAAGCTTGTCC TTCCCAGCCTCTAT-3'）編碼日本血吸蟲Akt蛋白的催化功能域部分CDS；將擴(kuò)增產(chǎn)物按常規(guī)方法克隆到pET28a(+)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行測序。

1.2.4 重組蛋白表達(dá)與純化 將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21中，挑取單克隆并將其置于5ml LB(Kan+)培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(37℃, 220 r/min)，取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液接種于100 mL 2×YT (Kan+)培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)(37℃, 220 r/min)，當(dāng)菌液OD600值為0.5時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，收集菌體，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白表達(dá)情況；采用超聲方法裂解菌體，分別收集包涵體和上清，SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)的蛋白為包涵體，用5 mL含8 mol/L尿素的PBS重懸，冰浴1 h，鎳柱親和層析純化重組蛋白，SDSPAGE電泳檢測純化效果，用6、4、2、1 mol/L尿素分別透析2 h進(jìn)行蛋白復(fù)性，并采用Bradford 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。

1.2.5 抗SjAkt重組蛋白多克隆抗體的制備 以純化的Akt重組蛋白免疫新西蘭大耳兔。首免取500 μg重組蛋白與206佐劑等體積混合，在漩渦振蕩器上乳化1 h，于兔背部皮下多點(diǎn)注射，每兩周加強(qiáng)免疫1次，免疫劑量為首次免疫的一半。第三次免疫后d 9耳緣靜脈采血10 mL， 37℃放置1 h，4℃靜置過夜，800g離心分離免疫血清，制備抗血清，-20℃保存。

1.2.6 Western blot分析 純化重組蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳，通過電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜上，然后用含3%BSA的TBST溶液中室溫震蕩孵育40 min，封閉結(jié)束后，將膜置入3%BSA TBST （含1:1000倍稀釋的SjAkt多抗），4℃搖床孵育過夜。結(jié)束后，將膜用TBST洗3次，每次5min。然后將膜置入含堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔IgG二抗(1:3000稀釋)的TBST溶液中，孵育1h，然后TBST溶液洗膜3次，每次5 min,將堿性磷酸酶底物反應(yīng)液滴于硝酸纖維薄膜上,反應(yīng)5 min，顯色結(jié)束后膜浸于超純水中終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析表明日本血吸蟲NCBI數(shù)據(jù)庫中有3個EST含有Akt保守結(jié)構(gòu)域，基因組預(yù)測的蛋白數(shù)據(jù)庫中有2個預(yù)測的Akt蛋白序列（表1），對此進(jìn)行多序列比對分析，蛋白序列AAW25998.2包括蛋白序列AAP06192.1和CPRT0000011075，蛋白序列CPRT0000010548包括蛋白序列AAW24576.1(圖1)。蛋白保守功能結(jié)構(gòu)域分析表明AAW25998.2含有不完整的Akt蛋白保守的催化結(jié)構(gòu)域、羧基末端結(jié)構(gòu)域及活性位點(diǎn)；基因組預(yù)測的蛋白CPRT0000010548含有PH結(jié)構(gòu)域及不完整的催化結(jié)構(gòu)域，且存在保守的ATP結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明AAW25998.2、CPRT0000010548與曼氏血吸蟲Akt蛋白具有較為相近的親緣關(guān)系(圖2)。

表1 日本血吸蟲Akt蛋白的序列分析結(jié)果Table 1 The results of data mining for searching Akt proteins in Schistosoma japonicum

圖1 Akt蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Conserved domains analysis of three EST and two predicted proteins

2.2 PCR擴(kuò)增編碼SjAkt cDNA序列 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增Akt蛋白催化功能域的編碼cDNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示獲得單一目的條帶(圖3)，條帶大約800 bp。

2.3 原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-SjAkt構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III對PCR產(chǎn)物和pET28a(+)載體進(jìn)行雙酶切，膠回收后在T4 DNA連接酶的作用下連接克隆，轉(zhuǎn)化涂板，菌液PCR篩選陽性克隆。雙酶切結(jié)果表明成功克隆目的片段(圖4)，同時測序結(jié)果顯示序列完全正確，大小為819bp。

表2 Akt蛋白系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Phylogenetic tree of Akt proteins

圖3 PCR擴(kuò)增SjAkt編碼cDNAFig.3 Amplif i cation of a cDNA fragment encoding SjAkt by PCR

圖4 pET28a(+)-SjAkt雙酶切鑒定結(jié)果Fig.4 Restriction enzyme digestion analysis of pET28a(+)-SjAkt plasmid by EcoR I and Hind III

2.4 重組蛋白表達(dá)純化 測序正確的重組質(zhì)粒pET28a(+)-SjAkt轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.5時加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，采用超聲方法裂解菌體，分別收集包涵體和上清，SDSPAGE電泳檢測表達(dá)的蛋白為包涵體；用5 mL含8 mol/L尿素的PBS溶解包涵體后，通過鎳柱親和層析得到高純度的重組融合蛋白，重組蛋白大小在35 kDa左右 (圖 5)。

圖5 10% SDS-PAGE分析純化重組蛋白Fig.5 10% SDS-PAGE analysis of purif i ed recombinant protein

2.5 Western blot分析 利用本研究中制備的多克隆抗體，Western blot分析日本血吸蟲重組蛋白Akt,結(jié)果顯示在35 kDa位置出現(xiàn)單一條帶(圖6)，且與日本血吸蟲重組蛋白分子量一致，表明該免疫血清能識別日本血吸蟲重組蛋白SjAkt。

圖6 重組蛋白SjAkt的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis for recombinant protein of polyclonal antibodies

3 討論

Akt蛋白是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)外許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要節(jié)點(diǎn)，大量研究表明，Akt可調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育、凋亡和增殖等多種生物行為,在生物體的生長發(fā)育過程中扮演重要角色。隨著對Akt蛋白的深入研究，Akt的一些下游因子也逐漸引起人們關(guān)注，比如其下游分子GSK3[9]，活化的GSK3不僅參與胰島素信號通路，而且參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及Wnt等信號通路，調(diào)節(jié)生物體的生長發(fā)育。

日本血吸蟲的生活史比較復(fù)雜，其生長發(fā)育過程離不開精確的信號傳導(dǎo)，目前研究者對多個信號蛋白分子進(jìn)行了初步探究，如WD101、Smad4[10-11]，但未見對血吸蟲Akt蛋白生物學(xué)功能及其下游分子的相關(guān)報道。

本研究發(fā)現(xiàn)在日本血吸蟲中存在2個Akt蛋白，蛋白保守功能結(jié)構(gòu)域分析表明這兩個Akt蛋白序列均含有保守的催化功能結(jié)構(gòu)域，序列同源比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明該蛋白與曼氏血吸蟲Akt蛋白具有較高的同源性。本研究還成功制備了Akt多克隆抗體，免疫印跡法分析表明該多克隆抗體可特異性識別日本血吸蟲重組蛋白Akt，抗體特異性較好，可用于免疫組織化學(xué)和免疫印記檢測，為進(jìn)一步研究Akt蛋白在血吸蟲中的生物學(xué)功能及發(fā)現(xiàn)其下游分子在奠定基礎(chǔ)。

[1]Staal S P , Hartley J W, Rowe W P.Isolation of transforming murine leukemia viruses from mice with a high incidence of spontaneous lymphoma[J].Proc Natl Acad Sci USA , 1977, 74(7) : 3065 - 3067.

[2]Cheng G Z, Park S, Shu S.Advances of Akt pathway in human oncogenesis and as a target for anti-cancer drug discovery[J].Curr Cancer Drug Targets, 2008, 8(1): 2-6.

[3]Liang J, Slingerland J M.Multiple roles of the PI3K/PKB(Akt) pathway in cell cycle progression[J].Cell Cycle,2003, 2(4): 339-345.

[4]Shtilbans V, Wu M, Burstein D E.Current overview of the role of Akt in cancer studies via applied immunohistochemistry[J].Ann Diagn Pathol, 2008, 12(2): 153-160.

[5] 黃娜, 朱靜,李為民.Akt與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].華西醫(yī)學(xué), 2010, 25(12): 2291-2292.

[6] Boker A, Rothenberg L, Hernandez C,et al.Human islet transplantation: update[J].World J Surg, 2001, 25(4): 481-486.

[7]Alessi D R, Andjelkovic M, Caudwell B,et al.Mechanism of activation of protein kinase B by insulin and IGF-1[J].EMBO J, 1996, 5(23): 6541-6551.

[8] Cross D A, Alessl D R, Cohen P,et al.Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by insulin mediated by protein kinase B[J].Nature, 1995, 378, 785-789.

[9] Sheelagh FRAME,Philip COHEN.GSK3 takes centre stage more than 20 years after its discovery[J].Biochem, 2001,359, 1-16.

[10]劉玲, 陳守義, 余新炳, 等.日本血吸蟲信號通路相關(guān)基因SjWD101 的生物信息學(xué)分析及其克隆與表達(dá)[J].中國人獸共患病學(xué)報 2009, 25(1): 4-5.

[11] Osman A, Niles E G, LoVerde P T.Expression of functional Schistosoma mansoni Smad4: role in Erkmediated transforming growth factor beta (TGF-beta)down-regulation[J].J Biol Chem, 2004, 279(8): 6474-6486.