蔡 蘭 ，韓紅玉 ，黃 兵 ，董 輝 ，趙其平 ，姜連連

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.紹興出入境檢驗(yàn)檢疫局，紹興 312000）

生物分類的目的是探索生物的系統(tǒng)發(fā)育及其進(jìn)化歷史，揭示生物的多樣性及其親緣關(guān)系，并建立多層次的以系統(tǒng)發(fā)育為依據(jù)的自然分類系統(tǒng)。從單一依賴于形態(tài)學(xué)特征（光學(xué)和電子顯微鏡為主要觀測(cè)手段）、生活史特征及宿主范圍來推測(cè)單細(xì)胞寄生生物間關(guān)系，發(fā)展到結(jié)合更廣的分子生物學(xué)特征來確定的原因在于，當(dāng)單細(xì)胞生物具有較大程度的形態(tài)學(xué)和生活史特征變化時(shí)，分子生物學(xué)特征能更真實(shí)準(zhǔn)確地反應(yīng)出這種變化關(guān)系[1]。分子分類方法以蛋白質(zhì)、染色體、核酸為材料，運(yùn)用同工酶電泳技術(shù)、免疫技術(shù)、分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)、DNA雜交、種群基因結(jié)構(gòu)分析和測(cè)序等技術(shù)進(jìn)行分析鑒定。rDNA基因是結(jié)構(gòu)保守、進(jìn)化速度緩慢的一種具有記錄生物進(jìn)化歷史的特征分子，以其為分類依據(jù)建立的系統(tǒng)發(fā)育分類系統(tǒng)只與生物的遺傳結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此rDNA基因分析在生物分類中得以普遍應(yīng)用[2]。

雞球蟲病是由一種或幾種艾美耳球蟲寄生于雞腸道引起的危害極為嚴(yán)重的全球性寄生蟲病，嚴(yán)重危害家禽的生長(zhǎng)發(fā)育。全球每年因雞球蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)24億美元[3]。由于每種雞球蟲的寄生部位、潛在期、卵囊大小、致病性等有所不同，因此，鑒定球蟲的傳統(tǒng)方法主要依賴于卵囊形態(tài)特征、潛在期、寄生部位和致病性等，但完成這些指標(biāo)的測(cè)定耗時(shí)較長(zhǎng)、比較繁瑣。近來，基于核糖體DNA（rDNA）的分子生物學(xué)方法已逐漸用于不同種雞球蟲的分類和鑒定[4,5]。

為了解雞球蟲不同種株間的親緣關(guān)系及其分類地位，本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的4種15株雞艾美耳球蟲18S rDNA進(jìn)行克隆、測(cè)序，并用DNAstar 5.0分別對(duì)孢子蟲綱各屬代表種、8種艾美耳球蟲、柔嫩艾美耳球蟲與巨型艾美耳球蟲各株孢子化卵囊的18S rDNA序列進(jìn)行同源性、系統(tǒng)發(fā)育樹分析，以進(jìn)一步明確所保藏的雞球蟲各種/株的分類地位，同時(shí)也為艾美耳球蟲分子遺傳學(xué)鑒定提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)所用蟲株 4種15株雞艾美耳球蟲（表1）均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所保存提供。

1.2 主要試劑 大腸桿菌DH5α為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所保存提供；pGEM-T easy vector質(zhì)粒購(gòu)自Promega公司；總DNA提取試劑DNAzsol購(gòu)自申能博彩生物科技有限公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、Tag Plus DNA聚合酶、IPTG、x-gal均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)球蟲18S rDNA引物，上游引物P1：5'-ACCTG GTTGA TCCTG CCAG-3'，下游引物 P2：5'-CTTCC GCAGG TTCAC CTACG G -3'，由上海賽百盛生物公司合成。

1.3 孢子化卵囊收集 將實(shí)驗(yàn)室保存的7株柔嫩艾美耳球蟲、2株堆形艾美耳球蟲、5株巨型艾美耳球蟲和1株毒害艾美耳球蟲純種孢子化卵囊分別接種10羽14日齡羅曼小公雞，其中柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲感染劑量為2×104個(gè)/羽，于感染后d 8收集盲腸中未孢子化卵囊；堆形艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲感染劑量為5×104個(gè)/羽，收集感染后d 5～8糞便中的未孢子化卵囊。收集的未孢子化卵囊按常規(guī)進(jìn)行孢子化，參考蔣建林等[7]和Shirley等[8]的方法純化孢子化卵囊。

1.4 總DNA的提取與PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物回收 分別取0.5 g純化的4種15株雞球蟲孢子化卵囊提取總DNA，具體操作按DNAzsol說明書進(jìn)行。取50～100 ng提取的總DNA為模板，加入5μL 10×PCR Buffer、1μL 10 mmol/L dNTP混合物、上下游引物各1μL（50 pmol/L）、2U Tag Plus DNA聚合酶，加ddH2O至總體積為50μL，混勻后輕微離心，于基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，61℃ 1 min，72℃ 2.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，分析后紫外燈下切取相應(yīng)片段，使用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 PCR產(chǎn)物連接及轉(zhuǎn)化 根據(jù)pGEM-T easy vector使用說明書，將PCR回收產(chǎn)物與pGEM-T easy vector連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后涂布在含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。

1.6 陽性克隆的鑒定 經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，隨機(jī)挑取白斑菌落5個(gè)分別接種于3 mL LB（含氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。取2μL培養(yǎng)過夜的菌液為模板，加入2.5μL 10×PCR Buffer、0.5μL 10 mmol/L dNTP混合物、上下游引物各0.5μL（50 pmol/L）、1U Tag Plus DNA 聚合酶，加ddH2O至總體積為25μL，混勻后輕微離心，于基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，61℃ 1 min，72℃ 2.5 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR結(jié)束后，取10μL PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，根據(jù)PCR產(chǎn)物大小確定是否為目的條帶。

1.7 測(cè)序與序列分析 將含有單一目的片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和經(jīng)鑒定正確的陽性克隆菌液，送至上海Invitrogen公司測(cè)序，所得序列經(jīng)BLASTn比對(duì)確認(rèn)和軟件DNAstar 5.0整理后登錄GenBank。測(cè)序后獲得的序列與從GenBank下載的孢子蟲綱16個(gè)蟲種的18S rDNA序列，用軟件DNAstar 5.0 MegAlign分組進(jìn)行多序列比對(duì)、同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建.

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增與鑒定 PCR擴(kuò)增獲得了4種15株雞球蟲的18S rDNA基因，大小約1800 bp左右（圖1），結(jié)果與預(yù)期大小一致。PCR產(chǎn)物連接pGEM-T easy克隆載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑挑選后，隨機(jī)挑選5個(gè)白斑，搖菌后進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果均為陽性。

圖1 PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Results of PCR amplif i cation for 18s rDNA

2.2 序列登錄和序列下載 將鑒定正確的陽性克隆菌測(cè)序結(jié)果與PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果比對(duì)，獲得的正確序列通過軟件DNAstar 5.0-SeqMan去除載體序列后，在NCBI網(wǎng)站上Blast同源性比對(duì)確認(rèn)后登錄GenBank（登錄號(hào)見表1），從GenBank下載的孢子蟲綱16個(gè)蟲種18S rDNA序列信息見表2。

表 1 15株雞艾美耳球蟲信息及獲得的18S rDNA序列GenBank登錄號(hào)Table 1 Information of 15 strains and accession numbers the obtained 18S rDNA in GenBank

續(xù)上表

表2 GenBank下載16個(gè)蟲種的18S rDNA序列信息Table2 Information of 18s rDNA genes of 16 species download from GenBank

2.3 序列比對(duì)和同源性分析 序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，8種雞球蟲的18s rDNA序列同源性在92.9%～99.4%之間，其中實(shí)驗(yàn)室保存的4種雞球蟲同源性在94.6%～99.4%之間，柔嫩艾美耳球蟲與毒害艾美耳球蟲之間的同源性最高（99.4%），毒害艾美耳球蟲與和緩艾美耳球蟲之間的同源性最低（92.9%）（表3）。5株巨型艾美耳球蟲的同源性在96.9%～99.8%之間（表4）。7株柔嫩艾美耳球蟲的同源性在99.0%～99.9%之間（表5）。

表3 8種雞球蟲18S rDNA序列同源性和差異性Table 3 Percent identity and divergence among 18S rDNA sequences of 8 species of Eimeria

表4 5株巨型艾美耳球蟲18S rDNA序列序列同源性和差異性Table 4 Percent identity and divergence among 18S rDNA sequences of 5 strains of E.maxima

表5 7株柔嫩艾美耳球蟲18S rDNA序列同源性和差異性Table 5 Percent identity and divergence among 18S rDNA sequences of 7 strains of E.tenella

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 頂復(fù)器門（Apicomplexa）孢子蟲綱（Sporozoasida）9個(gè)屬蟲種的18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹形成5個(gè)分支（圖2），分別為1）B.bennetti、T.gondii和S.lacertae，2）ETAS和I.robini，3）B.divergens和T.ovis，4）C.parvum，5）P.berghei。

8種雞艾美耳球蟲的18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹形成2個(gè)分支（圖3），分別為1）E.mitis、E.mivati、E.brunetti、EMSH、E.praecox、EASH 組成1個(gè)大支，其中E.mitis與E.mivati、EMSH與E.praecox為兩組姊妹支，E.mitis、E.mivati和E.brunetti親緣關(guān)系較近；2）ENSH與ETAS形成1個(gè)獨(dú)立的分支。

圖2 孢子蟲綱9個(gè)蟲種18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree for 18S rDNA sequences of 9 species of Sporozoasida

圖3 8種雞球蟲18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree for 18S rDNA sequences of 8 species of Eimeria

5株巨型艾美耳球蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹形成2個(gè)分支（圖4），分別為1）EMBA、EMTY和EMTO，2）EMSH、EMLY。7株柔嫩艾美耳球蟲（ETAS、ETKF、ETYM、ETWU、ETBJ、ETQD 和 ETWL）的系統(tǒng)發(fā)育樹也形成2個(gè)分支（圖5），ETWL與另6個(gè)株的距離較遠(yuǎn)。

圖4 5株巨型艾美耳球蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree for 18S rDNA sequences of 5 strains of E.maxima

圖5 7株柔嫩艾美耳球蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree for 18S rDNA sequences of 7 strains of E.tenella

3 討論

生物的表型性狀是其遺傳信息在特定外界環(huán)境條件下的表達(dá)，因此以表型性狀為主要分類依據(jù)的傳統(tǒng)分類系統(tǒng)難以完全排除環(huán)境因素的影響以反映生物體之間的親緣關(guān)系。rDNA基因序列的分析和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)化模式的闡述，為生物提供了豐富而有價(jià)值的分類信息。根據(jù)信息的來源可以找到從界到種各級(jí)分類階元的分子特征，建立生物分子分類標(biāo)準(zhǔn)，糾正以表型性狀為主要依據(jù)的傳統(tǒng)分類系統(tǒng)，完善系統(tǒng)發(fā)育分類體系，探求生命起源和生物的進(jìn)化[9]。rDNA基因功能上具有高度保守性，在所有細(xì)胞生物中都存在，進(jìn)化具有良好的時(shí)鐘性質(zhì)，其序列中不同位置上變化的速度不同。由于18S rDNA基因在生物進(jìn)化過程中具有高度保守性，常用來分析物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系或利用特異性引物PCR進(jìn)行病原檢測(cè)等，目前也廣泛應(yīng)用于寄生蟲分子分類研究中，如牛泰勒蟲[10]、錐蟲[11]等分類與進(jìn)化研究。

本研究通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的4種15株雞艾美耳球蟲18s rDNA序列進(jìn)行克隆和分析，發(fā)現(xiàn)4種雞艾美耳球蟲不同種間同源性在94.6%～99.4%之間，巨型艾美耳球蟲株間的同源性在96.9%～99.8%之間，柔嫩艾美耳球蟲株間的同源性在99.3%～99.9%之間。這說明：第一，種間同源性不一定比株間同源性低，柔嫩艾美耳球蟲與毒害艾美耳球蟲之間高度同源（同源性達(dá)99.4%），而巨型艾美耳球蟲2個(gè)蟲株（EMBA和EMSH）間的同源性僅有96.9%；第二，柔嫩艾美耳球蟲株間同源性很高，說明進(jìn)化速度緩慢，株間變異較小；第三，巨型艾美耳球蟲株間同源性差異較大，說明其進(jìn)化速度很快，株間變異較大，這與巨型艾美耳球蟲不同地理株之間的抗原變異最大是一致的。

根據(jù)18S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，孢子蟲綱9個(gè)屬蟲種的親緣關(guān)系與傳統(tǒng)分類一致。如柔嫩艾美耳球蟲（ETAS）與諾氏等孢球蟲屬于同一分支，這2個(gè)蟲種在傳統(tǒng)分類上同屬于艾美耳科；貝氏貝諾孢子蟲、剛地弓形蟲、蝎虎肉孢子蟲同屬一支，其在傳統(tǒng)分類上都屬于肉孢子蟲科；而瘧原蟲、隱孢子蟲在傳統(tǒng)分類上各屬于不同的科，其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)而成為獨(dú)立一支。8種雞艾美耳球蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，柔嫩艾美耳球蟲與毒害艾美耳球蟲的相似性最高，親緣關(guān)系最近，形成一個(gè)獨(dú)立的分枝，這與其生物學(xué)特性一致，二者都在盲腸發(fā)育成卵囊，是致病力最強(qiáng)的兩個(gè)種。和緩艾美耳球蟲與變位艾美耳球蟲形成一個(gè)獨(dú)立分支，再與其他4種球蟲聚為一大支，這與6種球蟲都寄生于雞小腸的生物學(xué)特性一致。和緩艾美耳球蟲與堆形艾美耳球蟲（EASH）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這也進(jìn)一步證明這兩個(gè)種是獨(dú)立種。雞球蟲不同株間的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，地理距離的遠(yuǎn)近與其親緣關(guān)系有關(guān)。如7株柔嫩艾美耳球蟲中，來自國(guó)內(nèi)的6株組成一大分支，而來自美國(guó)的1株單獨(dú)為一分支；5株巨型艾美耳球蟲中，來自國(guó)內(nèi)的2株與來自美國(guó)的3株分別構(gòu)成二大分支。本文研究結(jié)果與Barta等[6]利用8種雞球蟲18S rDNA進(jìn)行全序列系統(tǒng)分析結(jié)果一致，也與利用雞球蟲其他相對(duì)保守基因—線粒體細(xì)胞色素C氧化酶Ⅰ亞基（mt COⅠ）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果一致[12]，表明18S rDNA序列不僅可用于球蟲的鑒定，還可用于檢測(cè)球蟲分離株的親緣關(guān)系，為球蟲的分子遺傳學(xué)鑒定提供了理論基礎(chǔ)。

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