李 東 ，朱 珠 ，石耀軍 ，陸 柯 ，彭金彪 ，洪 煬 ，張 旻 ，韓彥輝

（1.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241）

血吸蟲病是僅次于瘧疾的第二大熱帶病。血吸蟲終末宿主種類多以及中間宿主－釘螺分布廣等因素給血吸蟲病的防控帶來很大困難?，F(xiàn)在廣泛使用的吡喹酮化療對病人、病畜雖有較好的效果，但不能阻止重復感染，加之長期反復使用可使血吸蟲產(chǎn)生耐藥性，所以，加強血吸蟲病的疫苗研究是不可或缺的發(fā)展戰(zhàn)略。

血吸蟲基因工程疫苗研究已取得較大進展，發(fā)現(xiàn)了一些具有較高潛力的候選疫苗抗原分子，但迄今為止還未研制出一種穩(wěn)定的具有高保護力的疫苗[1]。下一步的研究方向一方面是繼續(xù)尋找新的疫苗候選分子，另一方面是對已篩選抗原開展佐劑篩選、免疫程序及免疫機理研究，以進一步提高其免疫保護效果。

血吸蟲為雌雄異體，在終末宿主體內(nèi)蟲體不增殖，雌雄蟲必須合抱后雌蟲才能性成熟，進而產(chǎn)卵[2]，蟲卵在肝臟內(nèi)部沉積形成肉芽腫是血吸蟲病的主要致病原因[3]。有研究表明，抱雌溝蛋白（Gynecophoral canal protein，GCP)基因是血吸蟲雄蟲特異性表達基因[4]，具有影響雌雄蟲體合抱的功能[5]。用重組日本血吸蟲抱雌溝蛋白（rSjGCP）免疫小鼠，可以誘導較高的減蟲率和減卵率。

本研究利用實驗室前期已構(gòu)建的抱雌溝蛋白重組表達質(zhì)粒pGEX-SjGCP轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行表達，純化得到與GST重組的融合蛋白，再分別以CFA/IFA、ISA206、ISA70M為佐劑免疫小鼠，通過流式細胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附檢測各免疫組T淋巴細胞亞群、細胞因子含量和特異性抗體水平，為了解重組SjGCP在小鼠體內(nèi)誘導的免疫保護機制積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和血吸蟲尾蚴 BALB/c小鼠，6～8周齡，購于中國科學院上海實驗動物研究中心；血吸蟲尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所提供，以新西蘭大白兔維系其生活史。

1.1.2 試劑和儀器 檢測淋巴細胞亞群熒光抗體及其同型對照購于美國BD Pharmingen公司；檢測淋巴細胞內(nèi)細胞因子熒光抗體及其同型對照購自美國BioLegend公司；免疫刺激劑購自美國Sigma公司；酶標二抗HRP Conjugated Goat anti-Mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3購自英國AbD serotec公司；HRP Conjugated Goat anti-Mouse IgG(H+L)購 自美 國KPL公 司；HRP-conjugated antimouse IgM購自美國Bethyl公司；HRP-conjugated antimouse IgE、IgA購自美國SouthernBiotech公司；可溶性單組分TMB底物溶液購自北京天根生物科技有限公司。

流式細胞儀、37℃孵箱、混勻振蕩器、離心機、加樣器、Tips流式上樣管、酶標板購自美國Costar公司；酶標儀購自美國BioTek公司；流式細胞儀購自美國Beckman coulter公司

1.2 實驗方法

1.2.1 重組抱雌溝蛋白（rSjGCP）和載體表達蛋白GST的表達、純化 將本實驗室已構(gòu)建的含有pGEX-SjGCP質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒pGEX-4T-2的菌株，以1:100比例分別接種于含Amp+的500 mL液體培養(yǎng)基培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)。當OD600達到0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導培養(yǎng)。當菌液OD值達到約2.0時，4℃，12 000×g離心10 min，收集菌體。加入15～20 mL PBST吹打至成為懸濁液，室溫-20℃反復凍融3次，380Hz，2秒×60次超聲破碎后，4℃，12 000×g離心10 min，分別收集沉淀和上清液，聚丙烯酰凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測蛋白表達情況。以8 mol/L尿素溶解含有pGEX-SjGCP質(zhì)粒菌沉淀，依次用含6、4、3、2、1、0 mol/L尿素的PBS進行梯度濃度透析。依據(jù)產(chǎn)品說明書用GST Bind Purification Kit分別對上述透析樣品及用含pGEX-4T-2的菌株制備上清中的目的蛋白進行純化。取純化后樣品20μL，進行常規(guī)SDS-PAGE，鑒定純度。用bradford蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒測定濃度后分裝凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 小鼠的免疫和感染 小鼠隨機分成10組，每組10只：PBS組，注射PBS；CFA/IFA佐劑組，注射CFA/IFA佐劑（第一次免疫以CFA作為佐劑，后兩次均用IFA）；ISA206佐劑組，注射ISA206佐劑；ISA70M佐劑組，注射ISA70M佐劑；GST-FCA組，注射載體表達蛋白GST與IFA/CFA佐劑；GST-206組，注射載體表達蛋白GST與ISA206佐劑；GST-70M組，注射載體表達蛋白GST與ISA70M佐劑； SjGCP- FCA組，注射重組蛋白SjGCP與IFA/CFA佐劑；SjGCP-206組，注射重組蛋白SjGCP與ISA206佐劑；SjGCP-70M組，注射重組蛋白SjGCP與ISA70M佐劑。小鼠免疫蛋白量為每只20 μg，免疫體積100 μL，佐劑與蛋白體積比分別為IFA/CFA 50:50、 ISA206 45:55、ISA 70M 35:65。分別在小鼠購入后的第2周、第4周和第6周進行3次皮下注射免疫。第3次免疫后1周，用(40±2)條日本血吸蟲尾蚴經(jīng)腹部皮膚貼片攻擊感染，感染后6周剖殺。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測T細胞增值以及細胞因子表達 第3次免疫后1周，每組取3只小鼠，剖殺，取脾進行研磨。將3只小鼠脾臟分離淋巴細胞混勻，計數(shù)，取含有106個細胞的懸液，加PBS至終體積為100 μL，每組3個樣品重復，待檢測。

依照文獻[6]方法進行T細胞檢測，于樣本中加入特異性熒光抗體PE-Cy5 CD3e、PE-CD4、FITC-CD8a(BD, America)，同型對照組加入同型抗 體 PE-Cy5 IgG1、PE-IgG2b、FITC- IgG2a(BD,America)，混勻細胞，4℃避光孵育30 min；然后用1 mL PBS洗滌，1800×g離心5 min，反復洗滌3次，去除多余抗體。最后用0.6 mL PBS 重懸細胞，上機檢測。

依照文獻[7]所示方法進行細胞內(nèi)因子檢測，對于準備檢測細胞因子 IL-2、IL-4、IFN-r、IL-10（BD, America）的樣本組和同型對照組，分別加入PMA+ Ionomycin(BD, America）進行刺激，同時加 入 Monensin（BD, America)，37℃，5% CO2溫箱孵育4～6 h。然后進行細胞表面標記，各實驗組和對照組均加入特異性熒光抗體 PE-Cy5 CD3e、PE-Cy7CD8a(BD，America)，避光孵育30 min，加入1 mL PBS洗滌3次。表面標記完成后每管加入0.5 mL細胞固定液，避光固定15 min，棄上清后用破膜劑（約100 μL）重懸細胞，孵育20 min后在樣本中加入細胞因子特異性抗體FITC-IL-2、PEIL-4、FITC-IL-10、 FITC-IFN-r(BD, America) 染色，分別以PE- IgG1、PE-Cy5 IgG1、FITC- IgG1(BD, America)作為同型對照。最后室溫避光孵育20 min，PBS洗滌一次后用洗滌1次后用0.6 mL PBS重懸，上機檢測，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.2.4 通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測特異性抗體 分別于免疫前（0周)、三免后(6周）以及攻擊感染后6周(13周)收集血清，通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中特異性抗體(lgG及其亞型lgG1)水平。純化重組日本血吸蟲抱雌溝蛋白(SjGCP)和載體表達蛋白GST，分別用包被緩沖液稀釋至10 μg/mL，加入96孔板（100 μL /孔），4℃包被過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液（PBST）洗3次，每次5 min。洗滌后，孔內(nèi)加入含4%牛血清蛋白（BSA）的封閉緩沖液，37℃溫箱中封閉1 h。加入100 μL洗滌緩沖液稀釋的待檢血清，37℃孵育1 h后洗滌。再加入新稀釋的酶標羊抗鼠抗體（ABD Serotec, England）100 μL。稀釋度IgG 1:6000，IgG1為 1:4000。接下來加入TMB底物溶液（TIANGEN China）100 μL/孔，37℃反應(yīng)20 min。最后加入終止液（2 mol/L硫酸50 μL/孔）終止反應(yīng)。使用酶標檢測儀（BIO-TEC Synergy HT），于450nm 測定各孔吸光值（A）。實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析 使用SPSS 11.0軟件作為分析工具，分別通過T檢驗（Student’st-test）和單因素方差分析(ANOVA)來對比各個組之間的差異顯著性（P≤0.05)，所有數(shù)據(jù)以 ±SD表示。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白rSjGCP及載體表達蛋白GST的純化 經(jīng)過GST Bind Purification Kit純化后，獲得了高純度的rSjGCP及載體表達蛋白GST，其SDSPAGE鑒定結(jié)果如如圖1所示。

2.2 T細胞亞群組成分析我 不同試驗組小鼠在第三次免疫之后取脾，研磨后熒光染色，通過流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞亞群占總的淋巴細胞的百分比。結(jié)果顯示，與PBS對照組比較，F(xiàn)CA/IFA佐劑組小鼠體內(nèi)CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞百分比顯著下降，而其CD4+T淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞的比值顯著上升；ISA70M佐劑組其CD8+T淋巴細胞顯著下降，CD4+T淋巴細胞無顯著變化，而CD4+T淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞的比值顯著上升；ISA206佐劑組CD4+T和CD8+T淋巴細胞無明顯變化。

圖1 純化重組蛋白rSjGCP和載體表達蛋白GST的SDSPAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purif i ed rSjGCP and GST

與PBS組比較，GCP-FCA組、GCP-206組和GST-206組小鼠 CD8+T淋巴細胞顯著下降，GST-206組、GST-70M組小鼠CD4+T淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞的比值顯著上升，GCP-70M的CD4+T淋巴細胞顯著下降；而與相應(yīng)GST組比較GCP-FCA組、GCP-70M組小鼠 CD8+T淋巴細胞顯著下降，GCP-FCA組、GCP-70M組CD4+T淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞的比值顯著上升（圖2、圖3）。

圖2 三免后組小鼠T淋巴細胞亞群組成分析Fig.2 The analysis of the composition of T lymphocyte subsets after the third immunity

注：* 與PBS組之間差異有統(tǒng)計學意義（P≤0.05）；# 與相應(yīng)的GST組之間差異有統(tǒng)計學意義（P≤0.05）

Note: * Signif i cant difference compared with PBS groups (P≤0.05); # Signif i cant difference compared with same adjuvant mixed withGST (P≤0.05)

圖3 三免后小鼠CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞比例分析Fig.3 The analysis of the value of CD4+T cells/CD8+ Tcells after the third immunity

2.3 細胞因子表達水平檢測結(jié)果 與PBS組小鼠比較，CFA/IFA佐劑組小鼠IL-4表達顯著升高；ISA206佐劑組IL-4、IL-10表達顯著升高；ISA70M組小鼠，但均未達到顯著性水平；GST-206組中IL-10表達顯著升高；GCP-FCA組和GCP-206組中IL-4、IL-10 表達水平均顯著上升；與相應(yīng)GST組比較，GCP-FCA組和GCP-206組中IL-4、IL-10 表達水平均顯著上升（圖4）。各組中IL-2、IFN-γ表達水平均有升高，但都未達到顯著性水平（圖5）。

圖4 三免后脾臟中分泌IL-4或IL-10的CD4+T淋巴細胞百分比Fig.4 The percentage of CD4+ T cells which secreted IL-4 or IL-10 after the third immunity in the spleen

圖5 三免后脾臟分泌IL-2或IFN-γCD4+T的淋巴細胞百分比Fig.5 The percentage of CD4+ T cells which secreted IL-2 or IFN-γ after the third immunity in the spleen

2.4 血清中抗體水平檢測 結(jié)果顯示，重組抗原免疫后，特異性抗體lgG1水平呈上升趨勢，其中三免后（6W）與PBS組比較，GCP-FCA組、GCP-206組、GCP-70M組特異性抗體lgG1顯著升高，感染后六周（13W）與PBS組比較GCP-206組、GCP-70M組特異性lgG1抗體仍然顯著性高表達；與相應(yīng)GST組比較，三免后（6W）GCP-FCA組、GCP-206組、GCP-70M組特異性抗體lgG1顯著升高，感染后六周（13W）GCP-206組特異性lgG1抗體仍然顯著性高表達。

3 討論

圖6 三次免疫后(6W)和感染六周后(13W)血液中抗體lgG1含量Fig.6 The level of lgG1 in the serum at 6 weeks( a week after the third immunity) and 13 weeks( 6 weeks after the infection)

研究表明，抱雌溝蛋白（Gynecophoral canal protein，GCP)基因是血吸蟲雄蟲特異性表達蛋白基因，且具有影響雌雄蟲體合抱的功能。在實驗動物免疫保護試驗中，SjGCP重組抗原或DNA疫苗誘導了部分的免疫保護效果。日本血吸蟲抱雌溝蛋白作為抗原免疫昆明系小鼠，獲得35.2%的減蟲率和37.8%肝臟減卵率[8]。以重組抱雌溝蛋白篩選日本血吸蟲成蟲噬菌體展示cDNA文庫獲得的陽性克隆免疫小鼠，分別獲得了40.53%、31.14%減蟲率以及35.31%、44.65%的減卵率[9]。將抱雌溝分泌蛋白保守區(qū)片段克隆到pcDNA3構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3-SjGCP，在小鼠日本血吸蟲病免疫保護試驗中，pcDNA3-SjGCP組的減蟲率為32.14%，減卵率為46.19%，與對照組pcDNA3相比差異顯著。以上結(jié)果均表明SjGCP是一個有潛力的血吸蟲疫苗候選抗原分子。

T淋巴細胞包括CD4+輔助性T淋巴細胞（Th細胞)、CD8+殺傷性T淋巴細胞和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞等。淋巴細胞中CD4+輔助性T淋巴細胞（Th細胞)和CD8+殺傷性T淋巴細胞（CTL細胞）的比值可以反映機體的免疫平衡狀態(tài)。本次試驗結(jié)果顯示，三次免疫后與PBS組相比，CFA/IFA佐劑組、GCP-70M組其CD4+T淋巴細胞百分比顯著降低，GCP-FCA組、GST-206組和GCP-206組小鼠CD8+T淋巴細胞百分比顯著下降；與GST組比較GCP-FCA組、GCP-70M組小鼠 CD8+T淋巴細胞百分比顯著下降。

免疫平衡是通過細胞因子和抗體等共同調(diào)節(jié)的，不同的細胞因子和抗體有不同的功能，這些細胞因子和抗體共同構(gòu)成了體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。研究發(fā)現(xiàn)：IL-2有刺激T淋巴細胞增殖分化的功能，同時誘導也Th0細胞向Th1細胞方向轉(zhuǎn)化。本研究中IL-2在各實驗組中表達均高于PBS組，但數(shù)據(jù)無顯著性差異。而IL-4可以抑制Th1型細胞分化，增強Th2型免疫反應(yīng)，IL-10則對IL-4過度表達有抑制作用[10]。GCP-FCA組、GCP-206組與PBS組和GST組比較IL-4和IL-10均顯著升高，顯示這幾組小鼠偏向于Th2的免疫狀態(tài)。而細胞因子IFN-γ對Th2型細胞分化均具有抑制作用[11-12]，本實驗中各實驗組IFN-γ含量與PBS組和相應(yīng)GST組比較沒有顯著性差異。

不同抗體也有不同的功能。實驗表明，用致弱尾蚴免疫狒狒和長尾猴，感染后其保護力水平與感染時宿主血清中的lgG水平呈現(xiàn)正相關(guān)，獲得最大保護力時lgG水平最高，抗體水平下降，保護力也下降。 抗體lgE以及抗體亞型IgG1在感染曼氏血吸蟲的人群中抵抗力有關(guān)[13]。本實驗中GCP-FCA組、GCP-206組和GCP-70M組三免后其IgG1水平顯著高于其PBS組和相應(yīng)GST組；感染六周后GCP-206組中IgG1仍較高且與其PBS組和相應(yīng)GST組比較有顯著性差異。

本研究對血吸蟲抱雌溝重組蛋白（SjGCP）免疫后小鼠的各種免疫效應(yīng)因子進行檢測分析，結(jié)果表明GCP-FCA、GCP-206免疫誘導了偏向于Th2型的免疫狀態(tài)。

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