朱 揚(yáng)， 張兆輝， 曾 偉， 高 延， 許澤武， 徐金梅

星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦組織中含量最多的一種細(xì)胞。近來研究發(fā)現(xiàn)正常生理?xiàng)l件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元起營養(yǎng)、支持和保護(hù)作用，而腦損傷可激發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞使其過度活化，釋放大量細(xì)胞因子，損傷神經(jīng)元，同時(shí)過度增殖的膠質(zhì)細(xì)胞形成膠質(zhì)瘢痕阻礙了損傷后的修復(fù)以及神經(jīng)元軸突再生，并明顯改變了局部正常結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元的生存環(huán)境。溶血磷脂酸是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞間磷脂類信號(hào)分子，是細(xì)胞存活、增殖及遷移的強(qiáng)有力的誘導(dǎo)因子。在急性缺血性心腦血管病、腦損傷時(shí)，血小板被凝血酶活化產(chǎn)生LPA并釋放到血清中，致使血清LPA水平大幅度增高，進(jìn)而促進(jìn)血腦屏障開放，引起神經(jīng)元凋亡、壞死等多種損傷［1，2］，嚴(yán)重影響腦血管疾病的預(yù)后。而LPA受體主要在AST中表達(dá)，AST為LPA在腦內(nèi)作用的主要靶細(xì)胞［3］。

因此，LPA與AST活化增殖的內(nèi)在關(guān)系已開始引起部分學(xué)者的關(guān)注。近年大量離體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)LPA能誘導(dǎo)AST增殖，但目前國內(nèi)外相關(guān)在體研究較少，而有關(guān)海馬區(qū)域相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

故本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察LPA對(duì)在體海馬AST的影響，從在體水平證實(shí)LPA誘導(dǎo)海馬AST增殖并探討其可能的作用機(jī)制，為急性缺血性腦血管病、腦損傷的理論及治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 立體定向儀、微量注射器、光學(xué)顯微鏡及手術(shù)器械等，溶血磷脂酸(Sigma公司)，U0126(Promega公司);小鼠來源磷酸化ERK1/2一抗、羅丹明標(biāo)記羊抗小鼠IgG、FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG、封閉用山羊血清(Santa Cruz公司);小鼠來源膠原纖維酸性蛋白一抗(Neo markers公司);封閉用小鼠血清(Boster公司);振蕩切片機(jī)，德國Leica公司產(chǎn)品;TCSSP2 AOBSMP型激光共聚焦顯微鏡，德國Leica公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 80只健康雄性SD大鼠，月齡2～3個(gè)月，體重200±25g，購于武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并隨機(jī)分空白對(duì)照組5只、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組25只、LPA組25只、LPA+U0126組25只，其中實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、LPA組和LPA+U0126組分別于注射 PBS、LPA、LPA+U0126 后1d、3d、5d、7d、14d后處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只?？瞻讓?duì)照組不注射藥物，直接處死。

1.3 動(dòng)物模型的制作 大鼠稱重，20%烏拉坦5ml/kg腹腔注射麻醉，固定于立體定位儀上，取前囟右側(cè)2.15mm，后3.00mm處用牙科鉆鉆孔，骨孔直徑約1.0mm，自顱骨表面垂直進(jìn)針3.00mm深;P組、L組、L+U組分別用緩慢注射推進(jìn)器注射PBS5μl和50μmol LPA5μl以及 U0126和 LPA 混合液5μl(0.2μl/min)，注射完畢后針頭在腦內(nèi)停留10min，緩慢退出。

1.4 切片制備 各組大鼠分別于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)開胸，用4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(PBS，pH=7.4)300ml進(jìn)行心臟灌注，灌注完后取腦置于4%多聚甲醛中固定24h。沖洗腦組織，用振蕩切片機(jī)在含海馬區(qū)的腦組織連續(xù)冠狀切片(FREE=5，F(xiàn)REQ=5)，片厚50μm。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)記染色 切片置于多聚賴氨酸包被的玻片上，加入封閉液1，置37℃濕盒中1h;滴加1∶300的小鼠GFAP單克隆抗體，置4℃冰箱中過夜;滴加1∶100Rodamin標(biāo)記羊抗小鼠IgG熒光二抗，置37℃濕盒1h;加入封閉液2，置37℃濕盒中1h;滴加1∶100小鼠 p-ERK單克隆抗體，置4℃濕盒中過夜;滴加1∶100FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG熒光二抗，置37℃濕盒中1h;甘油封固，加蓋蓋玻片。采用TCSSP2 AOBSMP型激光共聚焦顯微鏡檢查。用單位面積平均熒光強(qiáng)度(Average FI)表示GFAP和p-ERK1/2表達(dá)水平。計(jì)算公式如下:Average FI=FI/area(μm2)×100000。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示，各組間比較采用t檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析結(jié)果用Excel辦公軟件制成圖表。

2 結(jié)果

2.1 各組GFAP熒光強(qiáng)度時(shí)程變化 空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組GFAP單位面積平均熒光強(qiáng)度(Average FI)相當(dāng)，無顯著差異(P＞0.05);LPA注射后第3天，可見GFAP顯著增加(約4倍于基礎(chǔ)強(qiáng)度)，此后隨時(shí)間延長，GFAP熒光強(qiáng)度逐漸增加，至LPA注射后2w仍可見增加說明星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖時(shí)間至少持續(xù)2w。U0126與LPA混合液注射后，GFAP單位面積平均熒光強(qiáng)度輕度增加(約2倍于基礎(chǔ)水平)，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05)(見表1)。

表1 不同時(shí)間大鼠海馬區(qū)GFAP單位面積熒光強(qiáng)度(Average FI)值比較±s)

表1 不同時(shí)間大鼠海馬區(qū)GFAP單位面積熒光強(qiáng)度(Average FI)值比較±s)

與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較*P ＜0.05，#P ＜0.01;與 LPA+U0126組比較△P ＜0.05

GFAP組別 鼠數(shù)(只)單位面積熒光強(qiáng)度1d 3d 5d 7d 14d空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)對(duì)照組LPA組LPA+U0126組526.95 ±0.49117.27 ±1.24＊△65.34 ±1.1825252521.28 ±0.1920.00 ±0.4552.35 ±1.0934.82 ±0.5619.41 ±0.2679.00 ±0.79＊△49.15 ±0.7323.00 ±0.3491.14 ±1.12#△58.76 ±0.8424.00 ±0.1698.14 ±0.98＊△59.35 ±1.03

2.2 各組p-ERK磷酸化熒光強(qiáng)度變化 LPA注射后第5天誘導(dǎo)顯著的ERK 1/2磷酸化反應(yīng)，第7d增加到最高水平，后出現(xiàn)輕度下降，基本與GFAP熒光強(qiáng)度平行增長(見圖1)，與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)。LPA+U0126注射后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未見明顯的p-ERK1/2表達(dá)，但GFAP仍出現(xiàn)輕度的表達(dá)增加(見表1)，提示U0126能完全阻斷LPA誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化，但只部分抑制AST增殖(見圖1)。

2.3 LPA誘導(dǎo)的p-ERK表達(dá)在腦組織中的定位 在雙標(biāo)檢測中，早期在GFAP陽性細(xì)胞中LPA誘導(dǎo)的p-ERK1/2未見明顯的表達(dá)，而在注射部位的神經(jīng)元分布區(qū)有顯著的表達(dá)(見圖2A～C)。繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，注射后第14天在GFAP陽性細(xì)胞中有p-ERK1/2強(qiáng)烈的表達(dá)，且?guī)缀跞吭谠摷?xì)胞中表達(dá)(見圖2D)，提示LPA誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化早期主要在神經(jīng)元和其他細(xì)胞中表達(dá)，后期主要在AST中表達(dá)。

圖1 L組GFAP和p-ERK1/2熒光強(qiáng)度時(shí)程變化

3 討論

LPA是上世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)并開始研究的一種細(xì)胞膜脂類衍生物，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位出現(xiàn)最早的信號(hào)分子之一，它作為一種脂質(zhì)生長因子因其具有強(qiáng)烈的促增殖效應(yīng)而引起人們的廣泛關(guān)注。LPA具有促血小板聚集、平滑肌收縮、細(xì)胞增殖、增加緊密連接的通透性、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、壞死等多種生物學(xué)效應(yīng)，在中樞系統(tǒng)損傷性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

星形膠質(zhì)細(xì)胞增生(Astrocyte proliferation)是許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展過程中常見的病理改變。近年來研究發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生進(jìn)而形成膠質(zhì)瘢痕在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、變性性疾病以及癲癇中起著重要的作用［4］。而國內(nèi)外大量研究證實(shí)LPA的一個(gè)重要功能就是其能誘導(dǎo)多片腦區(qū)AST細(xì)胞增殖［5，6］，但關(guān)于 LPA 引起 AST 增殖的研究目前大多局限于細(xì)胞學(xué)水平，對(duì)于LPA誘導(dǎo)AST增殖的在體研究較少。Sorensen等［7］人的在體研究顯示，LPA能誘導(dǎo)大鼠紋狀體AST增殖。GFAP是特異性存在于AST中的中間絲，可用于標(biāo)記損傷后膠質(zhì)反應(yīng)，其陽性表達(dá)提示星形膠質(zhì)細(xì)胞的存在。本研究通過50μm LPA定位注射后發(fā)現(xiàn)大鼠海馬區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，隨時(shí)間延長，GFAP陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)逐漸增加，至少持續(xù)2w仍在快速增加。此結(jié)果提示LPA可以誘導(dǎo)大鼠海馬區(qū)AST增殖，這與細(xì)胞學(xué)研究結(jié)論相符，并首次在在體研究中證實(shí)之。但LPA作用途徑十分復(fù)雜，其促AST增殖機(jī)制尚不完全明了。

我們認(rèn)為在急性缺血性心腦血管病、腦出血、腦挫傷等疾病發(fā)生時(shí)出現(xiàn)血漿LPA大量增加，導(dǎo)致神經(jīng)元多種損傷，同時(shí)誘導(dǎo)AST大量增殖，形成膠質(zhì)瘢痕阻礙神經(jīng)元損傷后的修復(fù)以及其軸突再生，進(jìn)一步加重了神經(jīng)元細(xì)胞的損害。因此尋找一種有效的手段及時(shí)遏止AST的大量增殖可以有效地保護(hù)神經(jīng)元，減輕其不可逆損傷，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病的臨床治療上有著重要意義。目前研究已知LPA主要通過質(zhì)膜上的G蛋白偶聯(lián)受體LPA1、LPA2、LPA3和LPA4發(fā)揮生物學(xué)功能，與LPA受體耦聯(lián)的主要有3種 G蛋白，即 Gi/o、Gq/11和 G12/13。Yart等人［8］的研究表明LPA可以通過與 LPA1耦聯(lián)的Gi蛋白活化絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖，另有文獻(xiàn)報(bào)道LPA通過與LPA3耦聯(lián)的Gq蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］濃度，最終激活 MAPK途徑實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖［9］。而ERK1/2作為 MAPK家族的重要成員之一，廣泛存在于整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的信號(hào)系統(tǒng)中起著重要作用。ERK1/2激活后可磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白激酶等多種底物，參與多種細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡等細(xì)胞行為［10］。U0126為蛋白激酶阻滯劑，可以特異性阻斷ERK1/2信號(hào)途徑，抑制MAPKS級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與細(xì)胞周期調(diào)控［11］。LPA對(duì)AST的增殖效應(yīng)能被U0126阻斷，證明LPA可以通過p-ERK1/2誘導(dǎo)AST的增殖。

但在我們的實(shí)驗(yàn)中觀察到LPA對(duì)AST的增殖效應(yīng)沒有被U0126完全阻斷，注射U0126與LPA混合液的部位GFAP陽性細(xì)胞數(shù)目仍有少量增加。同時(shí)在雙標(biāo)檢測中我們還發(fā)現(xiàn)早期(＜7d)主要在神經(jīng)元分布區(qū)域而非AST分布區(qū)域大量表達(dá)，繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)p-ERK后期(14d)幾乎完全在AST表達(dá)。近年來有些學(xué)者認(rèn)為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間通過緊密連接等連接方式存在著廣泛的聯(lián)系從而構(gòu)成細(xì)胞之間信息交流的基礎(chǔ)［12］，因我們推測，本實(shí)驗(yàn)中觀察到的LPA誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化細(xì)胞分布的變化可能是AST的激活繼發(fā)于其他細(xì)胞的激活的結(jié)果，也許是在體條件下LPA誘導(dǎo)AST增殖的另一途徑，因而解釋了U0126只能部分阻斷AST的增殖這一現(xiàn)象。

我們的研究結(jié)果顯示LPA可通過磷酸化ERK1/2誘導(dǎo)AST增殖，這為臨床上尋找抑制急性缺血性腦血管病、腦損傷引發(fā)LPA的釋放導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞過度增生的治療提供了可能的藥物作用靶點(diǎn)。ERK抑制劑U0126的應(yīng)用提示在LPA誘導(dǎo)大鼠海馬AST增殖中，除了有MAPK/ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與外，還可能存在其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與，這還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

圖2 GFAP和p-ERK1/2雙標(biāo)圖(免疫熒光雙標(biāo)記法)

［1］ Chung SM，Bae ON，Lim KM，et al.Lysophosphatidic acid induces thrombogenic activity through phosphatidylserine exposure and procoagulant microvesicle generation in human erythrocytes［J］.Arterioscl Throm Vas，2007，(27):414 －421.

［2］ 余 櫻，張兆輝，楊 波，等.溶血磷脂酸對(duì)血腦屏障通透性的影響及其機(jī)制［J］.中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2006，15(12):1109 －1112.

［3］ Tabuchi S，Kume K，Aihara M，et al.Expression of lysophosphatidic acid receptor in rat astrocytes:mitogenic effect and expression of neurotrophic genes［J］.Neurochem Res，2000，25(5):573 － 582.

［4］ Li LX，Welser JV，Dore-Duffy P，et al.In the hypoxic central nervous system，endothelial cell proliferation is followed by astrocyte activation，proliferation，and increased expression of the alpha 6 beta 4 integrin and dystroglycan［J］.Glia，2010，58(10):1157 － 1167.

［5］ Shano S，Moriyama R，Chun J，et al.Lysophosphatidic acid stimulates astrocyte proliferation through LPA(1)［J］.Neurochem Int，2008，52(1-2):216－220.

［6］ Citro S，Malik S，Oestreich EA，et al.Phospholipase cepsilon is a nexus for rho and rap-mediated Gprotein-coupled receptor-induced astrocyte proliferation［J］.PNAS，2007，104(39):15543 － 15548.

［7］ Sorensen SD，Nicole O，Peavy RD，et al.Common signaling pathways link activation of murine PAR-1，LPA，and S1Preceptors to proliferation of astrocytes［J］.Mol Pharmacol，2003，64(5):1199 － 1209.

［8］ Yart A，Chap H，Raynal P.Phosphoinositide3-kinases in lysophosphatidic acid signaling:regulation and cross-talk with the Ras mitogen-activated protein kinase pathway［J］.BBA-Mol Cell Boil L，2002，1582:107 －111.

［9］ Kranenburg O，Moolenaar WH.Ras-MAP kinase signaling by lysophosphatidic acid and other G protein-coupled receptor agonists［J］.Oncogene，2001，20:1540 －1546.

［10］ Katagiri A，Nakayama K，Rahman MT，et al.MEK inhibition suppresses cell invasion and migration in ovarian cancers with activation of ERK1/2［J］.Exp Ther Med，2010，1(4):591 －596.

［11］ Farrokhnia N，Ericsson A，Terent A.MEK-inhibitor U0126 in hyperglycemic focal ischemic brain injury in the rat［J］.Eur JClin Invest，2008，38(9):679 －685.

［12］ Bruzzone S，Verderio C，Schenk U，et al.Glutamate-mediated over expression of CD38 in astrocytes cultured with neurones［J］.JNeurochem，2004，89(1):264 －272.