周珊珊， 劉麗娜， 馮連榮， 張黎明

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種年齡相關(guān)的進(jìn)行性、獲得性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，常表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙、記憶力減退。AD作為老年癡呆的主要原因其病因尚不清楚，而且缺乏有效的預(yù)防和治療方法。隨著我國(guó)老齡化加劇，AD患病率逐年增加，AD的預(yù)防和治療已經(jīng)成為一個(gè)重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn)題。目前研究認(rèn)為AD的病理基礎(chǔ)包括老年斑形成、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、神經(jīng)元缺失和膽堿能神經(jīng)元變性等［1］。在眾多的AD病因假說(shuō)中，自由基的產(chǎn)生被認(rèn)為是一個(gè)十分重要的因素。大量研究證據(jù)表明機(jī)體自由基產(chǎn)生和抗氧化系統(tǒng)作用失衡產(chǎn)生的氧化應(yīng)激在AD發(fā)病早期的神經(jīng)損傷中起重要作用［2］。我們旨在通過(guò)ICV-STZ建立模型，應(yīng)用新型自由基清除劑-依達(dá)拉奉進(jìn)行干預(yù)，研究依達(dá)拉奉對(duì)AD模型大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響，初步探討依達(dá)拉奉對(duì)AD模型大鼠認(rèn)知功能改善作用的機(jī)制，為AD的預(yù)防和藥物治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑 雄性成年SD大鼠48只，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重200～250g。按每組12只(6只用于生化檢測(cè)，6只用于免疫組化檢測(cè))隨機(jī)分成4組:假手術(shù)組(S)、依達(dá)拉奉 +假手術(shù)組(E+S)、ICV-STZ組(L)、依達(dá)拉奉+ICV-STZ組(E+L)。依達(dá)拉奉(南京先聲東元制藥有限公司)，鏈脲菌素(Streptozotocin，STZ，美國(guó) Sigma公司)，SOD、MDA 檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體(一抗，美國(guó)Santa Cruz公司)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG多克隆抗體(PV6001，二抗，北京中杉金橋公司)，3，3’-四鹽酸二氨基聯(lián)苯胺(DAB，北京中杉金橋公司)。

1.2 給藥方法 E+S組和E+L組大鼠每日分兩次腹腔注射依達(dá)拉奉3mg·kg－1，共14d。其余兩組每日腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3 AD模型的建立 依達(dá)拉奉干預(yù)14d后依照文獻(xiàn)［3］的方法制模:大鼠10%水合氯醛3ml·kg－1腹腔注射麻醉，頭部固定于立體定位儀上，沿頭部正中線做矢狀切口，分離皮下組織暴露顱骨。取前囟后0.8mm，左右旁開1.5mm顱骨打孔，垂直深度3.6mm微量加樣器緩慢雙側(cè)腦室內(nèi)注射STZ 3mg·kg－1。注入的STZ生理鹽水溶液體積控制在10μl左右，假手術(shù)組腦室內(nèi)注射相應(yīng)體積的生理鹽水。注射完畢用骨蠟封填顱骨缺損，縫合頭皮。48h后重復(fù)上述手術(shù)注藥過(guò)程。

1.4 Morris水迷宮評(píng)價(jià)認(rèn)知功能 第一次腦室內(nèi)注藥2w后行Morris水迷宮測(cè)試評(píng)價(jià)各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［4］。水迷宮的主要組成部分是一個(gè)直徑150cm，高60cm充滿水的圓形不銹鋼水池，水池分為4個(gè)象限，水池內(nèi)壁呈黑色。逃逸平臺(tái)是一個(gè)透明的直徑為10cm的可移動(dòng)圓柱形平臺(tái)，其表面距水面2cm。定向航行試驗(yàn):在測(cè)試中將平臺(tái)放置在任一象限，選擇某個(gè)象限將大鼠面朝池壁放入水中。大鼠到達(dá)平臺(tái)后令其在平臺(tái)停留30s，然后繼續(xù)下一次訓(xùn)練，每次尋找平臺(tái)時(shí)間不超過(guò)120s。每天訓(xùn)練4次，記錄大鼠每次到達(dá)平臺(tái)所用的時(shí)間，共訓(xùn)練5d?？臻g探索試驗(yàn):第6天將水下平臺(tái)撤去，將大鼠放入水中自由游動(dòng)120s，記錄大鼠在平臺(tái)所在目標(biāo)象限停留的時(shí)間。

1.5 SOD和MDA檢測(cè) 認(rèn)知功能評(píng)價(jià)后處死動(dòng)物，迅速取腦，冷鹽水沖洗去除血液和雜質(zhì)。分離海馬和皮質(zhì)組織稱重，用生理鹽水分別制成10%組織勻漿。組織勻漿經(jīng)4000g離心10min，取上清用于檢測(cè)。SOD和MDA的檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.6 免疫組化檢測(cè)Bcl-2 認(rèn)知功能評(píng)價(jià)后麻醉動(dòng)物，經(jīng)左心室插管，灌流生理鹽水和4%多聚甲醛。取腦，取視交叉前后2mm冠狀切片置于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，經(jīng)HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(SP法)檢測(cè)石蠟包埋切片中Bcl-2的表達(dá)。方法如下:石蠟切片經(jīng)常規(guī)處理，經(jīng)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷和抗原修復(fù)后滴加兔抗大鼠Bcl-2單克隆抗體(一抗)，4℃孵育過(guò)夜。次日滴加PV-6001(二抗)，室溫下孵育20min，經(jīng)DAB顯色，脫水，透明，封片。采用“雙盲法”在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià) Morris水迷宮評(píng)價(jià)和生化分析結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件系統(tǒng)作數(shù)據(jù)處理分析，統(tǒng)計(jì)分析方法為單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):在×400放大倍數(shù)下，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，胞漿或胞核染成棕黃色為陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞著色判斷(A):＜5%為0分;5% ～25%為1分;26% ～50%為2分;＞50%為3分。陽(yáng)性強(qiáng)度(B):無(wú)著色或與背景均勻一致的淡黃色為0分;淺棕黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。根據(jù)兩項(xiàng)指標(biāo)的積分?jǐn)?shù)(積分=A×B)進(jìn)行計(jì)分，2～3分為弱陽(yáng)性(+);4～6分為陽(yáng)性();7～9分為強(qiáng)陽(yáng)性()。

2 結(jié)果

2.1 認(rèn)知功能評(píng)價(jià) 定向航行試驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)各組大鼠的逃逸潛伏期均逐漸縮短。第5天各組大鼠逃逸潛伏期結(jié)果S組10.25±3.91，E+S組 13.65 ±4.24;L 組 77.71 ± 6.72，E+L 組29.08±4.52。L組比 S組潛伏期顯著延長(zhǎng)(P＜0.05);E+L組比L組潛伏期顯著縮短(P＜0.05);S組與E+S組比較結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(見圖1)?？臻g探索試驗(yàn)中，各組大鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間為 S組33.62 ±6.98，E+S組32.69 ±5.93;L組22.4 ±5.03，E+L 組32.89 ±6.21。L 組比 S組時(shí)間顯著減少(P＜0.05);E+L組比L組時(shí)間顯著增加(P＜0.05);S組與E+S組比較結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(見圖2)。

2.2 SOD和MDA檢測(cè) L組大鼠海馬和皮質(zhì)SOD含量比S組顯著減少(P＜0.05);E+L組大鼠海馬和皮質(zhì)SOD含量比L組顯著增加(P＜0.05)。L組大鼠海馬和皮質(zhì)MDA含量比S組顯著增加(P＜0.05);E+L組大鼠海馬和皮質(zhì)MDA含量比L組顯著減少(P＜0.05)。S組和E+S組的海馬和皮質(zhì)SOD和MDA含量分別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)(見表1)。

2.3 Bcl-2免疫組化檢測(cè)結(jié)果 L組(42%)海馬的表達(dá)陽(yáng)性率低于S組(92%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。E+L組(75%)海馬的表達(dá)陽(yáng)性率高于 L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。L組(33%)皮質(zhì)的表達(dá)陽(yáng)性率低于S組(92%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。E+L組(67%)皮質(zhì)的表達(dá)陽(yáng)性率高于L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表2)(見圖3)。

表1 各組大鼠海馬和皮質(zhì)SOD、MDA、GSH含量比較

表2 海馬齒狀回和皮質(zhì)顆粒細(xì)胞不同組間Bcl-2表達(dá)

圖1 Morris水迷宮各組大鼠逃逸潛伏期比較

圖2 Morris水迷宮各組大鼠目標(biāo)象限停留下時(shí)間比較

3 討論

氧化應(yīng)激是包括AD在內(nèi)的多種隨年齡進(jìn)展和年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因［5］。氧自由基能夠引起蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、核酸等生物活性分子的氧化修飾，使細(xì)胞原有的結(jié)構(gòu)和功能喪失，使多種生物酶失活，最終引起細(xì)胞凋亡［6］。對(duì)抗氧化應(yīng)激過(guò)程中，腦組織會(huì)代償性地加速Aβ生成［7］，氧化應(yīng)激還可誘導(dǎo) tau蛋白的磷酸化［8］。這些改變均能引起不同程度的神經(jīng)損傷，引起認(rèn)知功能的下降，促進(jìn)AD的進(jìn)展。

有研究表明ICV-STZ能夠引起大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，其原因是大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)、膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性降低、能量代謝障礙和tau蛋白生成增加等［9］。本實(shí)驗(yàn)觀察到ICV-STZ引起大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力顯著下降，大鼠腦內(nèi)SOD含量顯著下降，MDA的含量顯著增加。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠清除自由基，具有抗氧化應(yīng)激損傷的作用。MDA是體內(nèi)自由基對(duì)不飽和脂肪酸引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的分解產(chǎn)物，其含量的多少可間接反應(yīng)脂質(zhì)過(guò)氧化水平的高低和對(duì)細(xì)胞的損傷程度。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)ICV-STZ引起腦內(nèi)氧化應(yīng)激增強(qiáng)是大鼠認(rèn)知功能下降的重要原因。

依達(dá)拉奉是一種新型強(qiáng)力自由基清除劑。在以往的研究中，依達(dá)拉奉做為一種神經(jīng)保護(hù)劑常用于缺血和出血性腦血管病的治療，顯示了較好的療效。近年來(lái)，一些研究針對(duì)依達(dá)拉奉對(duì)非腦血管病的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療作用進(jìn)行了探索。Anuj等研究證明依達(dá)拉奉能夠改善糖尿病周圍神經(jīng)病大鼠的神經(jīng)傳導(dǎo)速度和坐骨神經(jīng)的氧化應(yīng)激水平［10］。最近有研究證明依達(dá)拉奉對(duì)PrP106-126損傷的PC12細(xì)胞有保護(hù)作用，進(jìn)而推測(cè)依達(dá)拉奉可能對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病具有預(yù)防和治療作用［11］。本研究應(yīng)用依達(dá)拉奉干預(yù)STZ誘導(dǎo)的AD模型大鼠，結(jié)果表明依達(dá)拉奉能夠顯著改善AD模型大鼠的認(rèn)知功能，逆轉(zhuǎn)了STZ引發(fā)的大鼠腦內(nèi)SOD減少和MDA增加。以往研究表明凋亡在AD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。凋亡的刺激因素包括氧化應(yīng)激、能量代謝障礙、線粒體功能失調(diào)、Aβ沉積、DNA損傷等［12］。在AD患者的腦組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族和caspase家族凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)嚴(yán)重失衡［13］。Bcl-2是抗凋亡蛋白的重要成員之一，Katare等發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉能夠上調(diào)缺血再灌注損傷大鼠心肌組織的Bcl-2表達(dá)以對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷，減少細(xì)胞凋亡［14］。本研究中STZ誘導(dǎo)的AD模型組大鼠海馬和皮質(zhì)腦組織Bcl-2表達(dá)顯著減少。依達(dá)拉奉預(yù)處理抑制了大鼠腦組織Bcl-2表達(dá)減少，從而減少了STZ誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

目前，包括AD在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病尚無(wú)有效的預(yù)防和治療方法。依達(dá)拉奉作為一種新型自由基清除劑其對(duì)神經(jīng)退行性疾病的防治作用正逐漸被人們認(rèn)識(shí)。本研究結(jié)果提示依達(dá)拉奉能夠保護(hù)AD模型大鼠的認(rèn)知功能損害，其作用可能是通過(guò)抑制氧化應(yīng)激損傷、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。該結(jié)果為自由基清除劑應(yīng)用于AD等神經(jīng)退行性疾病的防治提供了理論依據(jù)。然而，依達(dá)拉奉的這種保護(hù)作用是否存在其他的機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

圖3 海馬齒狀回和皮質(zhì)顆粒細(xì)胞不同組間Bcl-2表達(dá)

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