袁 征,徐文娟,彭 偉

血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及功能紊亂與高血壓、冠心病及糖尿病等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān),其中,細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細(xì)胞間黏附分子-1(vascular cellular adhesionmolecule-1,VCAM-1)和顆粒膜蛋白(PS)的含量變化與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)[1]。本實(shí)驗(yàn)以AngⅡ建立血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型,以加味芎藭湯含藥血清為干預(yù)因素,觀察含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的ICAM-1、VCAM-1和PS含量的影響,為加味芎藭湯治療與血管內(nèi)皮損傷相關(guān)聯(lián)的疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 加味芎藭湯中之銀杏葉、當(dāng)歸、酒大黃、川芎均由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供,并經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定為正品。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)由美國(guó)Sigma公司提供;卡托普利由山東濰坊制藥廠提供,批號(hào):10910005。

1.2 試劑 DMEM干粉培養(yǎng)、胎牛血清(FCS)、過(guò)氧化氫(H2O2)、胰蛋白酶,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(M TT),美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO),天津市福辰化學(xué)試劑廠;酶聯(lián)免疫吸附法ICAM-1與VCAM-1和PS測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)BPB生物醫(yī)學(xué)有限公司。

1.3 儀器 水套式二氧化碳孵箱,美國(guó)Nuaire公司產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡,全自動(dòng)生化分析儀:AU1000型,日本OLYMPUS公司產(chǎn)品;超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備公司產(chǎn)品;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,華東電子管廠產(chǎn)品;LX808動(dòng)力學(xué)定量繪圖酶標(biāo)儀,美國(guó)寶特原裝進(jìn)口產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(ECV-304),購(gòu)自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,由美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)ATTCCCRI-1998引進(jìn))。

1.4 含藥血清制備 雄性Wiatar大鼠10只,加味芎藭湯按13.3 g/(kg?d)灌胃給藥,連續(xù)7 d,于末次給藥2 h后,麻醉,取血,無(wú)菌分離血清,經(jīng)56℃、30 min滅活后,配置含藥血清培養(yǎng)液備用。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 采用胰蛋白酶消化傳代血管內(nèi)皮細(xì)胞,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),采用4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分組。①DMSO溶媒對(duì)照組;②AngⅡ組:AngⅡ2×10-7mol/L;③卡托普利組:AngⅡ2×10-7mol/L+160 mg/L卡托普利;④30%含藥血清組:AngⅡ2×10-7mol/L+30%含藥血清;⑤20%含藥血清組:AngⅡ2×10-7mol/L+20%含藥血清;⑥10%含藥血清組:AngⅡ2×10-7mol/L+10%含藥血清;⑦5%含藥血清組:AngⅡ2×10-7mol/L+5%含藥血清,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.6 細(xì)胞增殖活性測(cè)定 將4×104/mL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板,每孔200 μ L(8×103/孔)細(xì)胞懸液,同上分組和培養(yǎng)后,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)44 h,換含1%血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)液,每孔加入 MT T 20 μL(5 mg/mL),溫育4 h,每孔加入 150 μ L DMSO,混勻后于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)吸光度(OD),以O(shè)D值來(lái)表示細(xì)胞增殖活性。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清液 ICAM-1、VCAM-1和PS含量 采用酶聯(lián)免疫法(Elisa法)測(cè)定 ICAM-1、VCAM-1和 PS含量。繪制校正曲線,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作縱坐標(biāo),OD值作橫坐標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)觀察 低倍光鏡下觀察可見(jiàn),內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞呈單層扁平或多角形細(xì)胞。細(xì)胞核為圓形或橢圓形,核內(nèi)染色質(zhì)稀疏空亮,可見(jiàn)一兩個(gè)核仁。細(xì)胞生長(zhǎng)融合形成單層,呈典型的鵝卵石或鋪路石鑲嵌狀排列生長(zhǎng)。傳代12 h后,可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖呈小簇狀生長(zhǎng),24 h后,細(xì)胞生長(zhǎng)形成細(xì)胞群細(xì)胞團(tuán)塊中間較密,周邊細(xì)胞多為長(zhǎng)梭形并游離向外生長(zhǎng)。

2.2 對(duì)細(xì)胞增殖的影響 與DMSO溶媒組相比,AngⅡ各濃度組人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖顯著升高。選取2×10-7mol/L AngⅡ體外干預(yù)人血管內(nèi)皮細(xì)胞以引起細(xì)胞增殖。與AngⅡ組比較,200μ g/mL～400 μ g/mL各劑量卡托普利組細(xì)胞增殖活度均顯著減少(P＜0.05)。與AngⅡ組比較,5%～20%各劑量含藥血清組的細(xì)胞增殖活度均顯著減少(P＜0.05)。含藥血清在5%～20%劑量范圍內(nèi)能抑制AngⅡ?qū)?nèi)皮細(xì)胞的增殖效應(yīng),但作用強(qiáng)度有別。30%含藥血清組呈色極弱,鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量較少,大量細(xì)胞死亡,表明30%含藥血清對(duì)ECV304細(xì)胞增殖有極強(qiáng)的抑制作用,推測(cè)具有一定的細(xì)胞毒性效果。1%含藥血清組呈色較強(qiáng),接近正常細(xì)胞組,鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好,表明在該劑量對(duì)ECV304增殖無(wú)明顯的抑制作用。詳見(jiàn)表1。

表1 各組OD值的比較(±s)

表1 各組OD值的比較(±s)

組別 n 劑量 OD值DMSO溶媒組 4 ― 0.64±0.12 AngⅡ模型組 4 1×10-7mol/L 0.83±0.231)4 2×10-7mol/L 1.02±0.071)4 10×10-7mol/L 0.60±0.20卡托普利組 4 50 μ g/mL 0.66±0.052)4 200 μ g/mL 0.59±0.022)4 400 μ g/mL 0.48±0.132)4 1 000 μ g/mL 0.16±0.022)含藥血清組 4 1% 0.61±0.05 4 5% 0.55±0.10 4 10% 0.34±0.023)4 20% 0.25±0.023)4 30% 0.13±0.043)與DMSO溶媒組比較,1)P＜0.05;與AngⅡ模型組比較,2)P＜0.05;與卡托普利組比較,3)P＜0.05

2.3 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液ICAM-1、VCAM-1和PS含量的影響

各組與DMSO組比較內(nèi)皮細(xì)胞中的PS含量均明顯降低(P＜0.05)。模型組PS含量明顯降低,加入各組含藥血清后PS均有明顯升高,其中含藥血清的藥效比較為:卡托普利組＞10%組＞5%組＞20%組＞30%組。詳見(jiàn)表2。

模型組VCAM-1含量明顯升高(P＜0.05),加入各組含藥血清后VCAM-1均有明顯降低(P＜0.05),其中含藥血清的藥效比較為:20%組＞卡托普利組＞10%組＞5%組＞30%組。詳見(jiàn)表2。

模型組ICAM-1含量明顯上升(P＜0.05),加入各組含藥血清后ICAM-1均有明顯降低(P＜0.05),其中含藥血清的藥效比較為:卡托普利組＞10%組＞20%組＞30%組＞5%組。詳見(jiàn)表2。

表2 各組ICAM-1、VCAM-1、PS表達(dá)的比較(±s)ng/mL

表2 各組ICAM-1、VCAM-1、PS表達(dá)的比較(±s)ng/mL

組別 n ICAM-1 VCAM-1 PS DMSO溶媒組 6 38.80±13.28 26.17±3.63 13.19±7.08 AngⅡ模型組 6 53.11±5.88 52.58±38.432) 7.00±1.222)卡托普利組 6 33.00±1.991)2) 28.46±3.90 9.45±0.792)30%含藥血清組 6 46.94±15.67 48.35±21.252) 6.52±1.832)20%含藥血清組 6 35.77±5.941) 24.69±2.18 7.40±1.782)10%含藥血清組 6 35.35±4.901) 29.40±3.98 8.01±0.912)5%含藥血清組 6 48.78±10.37 38.92±6.54 7.91±1.392)與AngⅡ模型組比較,1)P＜0.05;與DMSO溶媒組比較,2)P＜0.05

3 討 論

目前認(rèn)識(shí)的黏附分子主要有ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素和P-選擇素。黏附分子參與內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板之間以及血管內(nèi)皮基質(zhì)之間的相互黏附與作用,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[1]。ICAM-1與VCAM-1的濃度升高被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞活化和炎癥的標(biāo)志[2]。

ICAM-1和VCAM-1同屬于免疫球蛋白超家族成員。ICAM-1廣泛地表達(dá)在各種血源性和非血源性細(xì)胞的表面,如白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等,通過(guò)與其配體β整合素-白細(xì)胞功能相關(guān)抗原1(LFA-1)和Mac-1(CD11b/CD18)的結(jié)合,主要介導(dǎo)多形核白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的黏附,促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展[3]。Min等[4]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)VEGF能使白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附增加,并使內(nèi)皮細(xì)胞表面ICAM-1與VCAM-1的表達(dá)增加。

PS是選擇素家族的重要成員,又名膜顆粒蛋白。P-選擇素主要分布于血小板表面和內(nèi)皮細(xì)胞Weibel-Palade小體中,在內(nèi)皮細(xì)胞活化時(shí),P-選擇素迅速表達(dá)在細(xì)胞膜上,介導(dǎo)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的起始黏附,并增加血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的親和力[5]。因此,PS在細(xì)胞表面的表達(dá)是內(nèi)皮細(xì)胞和血小板活化的標(biāo)志,它參與介導(dǎo)血小板的活化及內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的黏附,在炎癥、血栓形成中起重要作用。PS與其配體結(jié)合后起信號(hào)傳遞作用,活化靶細(xì)胞或改變其功能狀態(tài),從而介導(dǎo)白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞,參與血管局部的炎癥反應(yīng),進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷[6]。

ICAM-1和VCAM-1表達(dá)于受刺激迅速分泌PS的活化內(nèi)皮細(xì)胞表面,通過(guò)與其相應(yīng)配體結(jié)合介導(dǎo)白細(xì)胞與血管壁接觸,并使白細(xì)胞在激活的內(nèi)皮細(xì)胞表面緊密黏附,阻塞了毛細(xì)血管微循環(huán),進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷。Kacimi等[7]發(fā)現(xiàn)炎癥因子白介素(IL-1β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)可以增加內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞表面ICAM-1與VCAM-1的表達(dá),促進(jìn)二者的黏附,加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

加味芎藭湯由銀杏葉、當(dāng)歸、酒大黃、川芎組成,具有活血祛瘀、行氣通脈之功,是治療急性腦缺血有效復(fù)方。抑制急性腦缺血大鼠模型腦皮質(zhì)局部和血液中白細(xì)胞的ICAM-1表達(dá)和白細(xì)胞的聚集,發(fā)揮改善急性腦缺血的作用。但否能夠抑制白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附與聚集尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)選擇AngⅡ建立血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷為研究對(duì)象,以加味芎藭湯含藥血清干預(yù)手段,觀察到加味芎藭湯含藥血清降低內(nèi)皮細(xì)胞分泌的ICAM-1、VCAM-1,升高內(nèi)皮細(xì)胞分泌的PS,從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮的黏附功能。

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