王冬敏 林健雄 彭東東 李進展 李耿聰 李鴻檳 陳蕊明

吡嗪酰胺是一種重要的一線抗癆藥物，由于其可殺滅酸性巨噬細胞內的結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）和半休眠菌，可使結核病的復發(fā)率大大下降，在現(xiàn)代結核病控制策略中廣泛應用于短程化療方案，幾乎100%的新發(fā)結核病患者開始治療時都使用吡嗪酰胺，因此耐吡嗪酰胺的Mtb也越來越多，據(jù)文獻［1]統(tǒng)計為5.8%～18.6%，特別是近年來吡嗪酰胺的耐藥率明顯上升，甚至有些國家和地區(qū)報道的吡嗪酰胺耐藥率高達50.9%［2]。藥物敏感度試驗是實驗室指導臨床第一線科學用藥的重要手段之一。大多數(shù)藥敏試驗都可以在pH中性的常規(guī)培養(yǎng)基上順利進行，但吡嗪酰胺藥敏試驗例外，由于吡嗪酰胺僅在pH為5.5的酸性條件下才能轉化為殺菌的吡嗪酸，而Mtb在酸性條件下生長很差，甚至不生長，從而導致吡嗪酰胺的敏感試驗一直是實驗室中的一個難題。過去吡嗪酰胺的敏感試驗一直沿用酸羅氏法，但由于羅氏培養(yǎng)基中所含蛋白質對藥物有吸附作用，且在酸性條件下，Mtb生長緩慢，甚至不生長，從而使酸羅氏法耗時長，需3～4周，而且結果不夠穩(wěn)定，可靠性差，已不能完全適應臨床快速敏感試驗的要求［3－4]，因而目前我國的大多數(shù)結核病實驗室沒有常規(guī)開展吡嗪酰胺的藥敏試驗。國外經濟發(fā)達國家通常使用BACTEC MGIT－960、BacT／ALERT 3D 儀器的快速培養(yǎng)方法，但成本昂貴，制約了其推廣應用。為了更好地指導臨床對吡嗪酰胺的使用，有必要研究開發(fā)一種準確、快速、廉價的吡嗪酰胺藥敏試驗方法，以解決這一長期困擾臨床治療的難題。本研究應用顆粒顯色指示法測定102株Mtb的吡嗪酰胺耐藥性，并與BACTEC MGIT－960法結果進行比較，現(xiàn)將結果報道如下。

材料和方法

一、材料

1.待測菌株：102株 Mtb臨床分離株均選自汕頭市結核病防治所2011年3—5月結核病患者的標本BACTEC MGIT－960初培養(yǎng)陽性菌株，經抗酸染色確認為抗酸桿菌，并經常規(guī)生化反應鑒定為Mtb。

2.細菌生長指示管（bacterial growth indicator tube，BGIT）：含0.075g氧化還原指示顆粒，用于指示微生物的繁殖（專利申請?zhí)枺?01010242710.7），批號：20101026；通用增菌培養(yǎng)基：含有 Middlebrook7H9營養(yǎng)肉湯、牛血清白蛋白、觸酶、多肽等特殊營養(yǎng)成分（注冊號：滬食藥監(jiān)（準）2011第1400182號），為滿足吡嗪酰胺藥敏試驗要求，通用增菌培養(yǎng)基的pH已調整至最佳（pH 6.0～6.1之間），批號：20101012；吡嗪酰胺藥物：含量為2000μg／ml；由上海積彩醫(yī)療器械有限公司提供。

3.BACTEC MGIT－960吡嗪酰胺藥敏專用分枝桿菌生長指示管、藥敏試劑及960系統(tǒng)，由美國BD公司提供。

二、方法

對以上待測菌株同步進行顆粒指示顯色法和BACTEC MGIT－960法吡嗪酰胺藥敏實驗，操作均在Ⅱ級生物安全柜中進行。

1.顆粒指示顯色法：（1）取2支細菌生長指示管，在標簽處標記標本號，其中1支標注為1／10參照，另1支標注為藥敏管。（2）取1管4.9ml通用增菌培養(yǎng)基，用吸槍各精確吸取2ml培養(yǎng)液加入到細菌生長指示管中，余下含0.9ml培養(yǎng)液的管標注為稀釋管。（3）吸0.1ml吡嗪酰胺藥物加入藥敏管，使藥敏管中藥物的最終濃度為100μg／ml。（4）菌液標本取自BACTEC MGIT－960儀器提示陽性不超過24h的培養(yǎng)管，用吸槍反復吹打均勻后，吸取0.1ml菌液加入稀釋管，經充分混勻后吸0.1ml稀釋液加入1／10參照管；吸0.1ml原菌液加入藥敏管。（5）接種后置37℃培養(yǎng)，每天取出觀察生長指示管。當參照管出現(xiàn)紫色顆粒時判斷結果，藥敏管無紫色顆?；蜃仙w粒少于對照管判定為敏感，藥敏管中紫色顆粒多于或等同于參照管時判定為耐藥。結果判定方法見圖1。

圖1 吡嗪酰胺的藥敏試驗結果判定示意圖

2.BACTEC MGIT－960法吡嗪酰胺藥敏實驗按BACTEC MGIT－960操作手冊進行，由儀器讀取報告結果。

三、統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計結果用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT－960法檢測吡嗪酰胺藥敏結果比較（表1）

兩種方法檢測結果均為敏感67株，均為耐藥30株，總符合率為95.1%（97／102）。5株菌株兩種方法檢測結果不符，其中3株顆粒顯色指示法測定為敏感，BACTEC MGIT－960法測定為耐藥；2株為顆粒顯色指示法耐藥，BACTEC MGIT－960法檢測為敏感。如以BACTEC MGIT－960法測定吡嗪酰胺耐藥性結果為考核標準，則顆粒顯色指示法檢測吡嗪酰胺耐藥性的敏感度為90.9%（30／33），特異度 為 97.1% （67／69），陽 性 預 測 值 為 93.8%（30／32），陰性預測值為95.7%（67／70），準確性為95.1%（97／102）。

二、顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT－960法檢測吡嗪酰胺藥敏報告時間比較

結果顯示顆粒顯色指示法出現(xiàn)陽性結果的最早時間是7d，最晚時間為14d，平均（9.47±1.66）d；BACTEC MGIT－960法出現(xiàn)陽性結果的最早時間是6d，最晚時間為13d，平均（9.33±1.77）d，兩者差異無統(tǒng)計學意義（t＝0.573，P＞0.05）。詳見表2。

表1 顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT－960法檢測吡嗪酰胺藥敏結果比較（株）

表2 顆粒顯色指示法與BACTEC MGIT－960法檢測吡嗪酰胺藥敏報告時間比較

討 論

吡嗪酰胺是治療結核病最有效的一線藥物中的重要藥物，該藥物于1940年由Hall等在合成氨基吡啶過程中作為一種中間化合物首次被合成［5]，它的抗結核菌活性于1952年被Yeager等發(fā)現(xiàn)。但其與利福平和異煙肼聯(lián)用治療結核病顯著縮短化療時間的獨特作用是在其用于治療結核病29年之后的1981年才見報道［6]。吡嗪酰胺用于治療結核病至今已有半個世紀，其抗菌機制為：吡嗪酰胺是一種煙酰胺類似物，與異煙肼相似也是一種抗Mtb的原藥，但其發(fā)揮作用所要求的環(huán)境不同，吡嗪酰胺需要在酸性環(huán)境才表現(xiàn)抗菌活性且最低抑菌濃度（MIC）與pH值在7.0以下存在很好的正相關性［7]。吡嗪酰胺通過被動擴散進入Mtb細胞內，在Mtb細胞內由吡嗪酰胺酶（PZase）將其轉化為具有抗Mtb活性形式的吡嗪酸，所以PZase活性對吡嗪酰胺表現(xiàn)抗Mtb活性是必需的，眾多的研究結果支持pncA基因的突變造成PZase活性降低或喪失是Mtb產生對吡嗪酰胺耐藥的主要原因，隨著研究的深入，亦有很多研究結果表明，并不是所有耐藥菌株都存在pncA基因突變，大約70%的吡嗪酰胺耐藥菌株存在pncA基因突變，而且pncA基因存在突變但PZase還保持活性，因而目前通過基因檢測的手段檢測吡嗪酰胺耐藥性的方法尚未成熟［8]。

目前，檢測吡嗪酰胺耐藥性的方法主要有用羅氏培養(yǎng)基的絕對濃度法藥敏試驗、快速培養(yǎng)儀檢測法和分子生物學檢測技術。由于吡嗪酰胺在體外酸性環(huán)境中才能表現(xiàn)出抗菌活性，而Mtb在酸性環(huán)境下生長不良，使得常規(guī)方法測定吡嗪酰胺的耐藥性存在一定困難，而且耗時長、準確性差。從而導致吡嗪酰胺的敏感試驗一直是實驗室中的一個難題，中國防癆協(xié)會2009年出版的《結核診斷實驗室檢驗規(guī)程》里亦沒有頒布吡嗪酰胺的藥敏試驗方法。分子生物學檢測技術快速，但操作繁瑣，且突變檢出率偏低，pncA基因檢測法在3種方法中最快速，可彌補常規(guī)藥敏試驗的不足，但國內王金河等［4]的研究報道與酸羅氏法的符合率為75%，符合70%左右的吡嗪酰胺耐藥株存在pncA基因突變這一耐藥分子機制，但仍有30%左右的菌株不能用此方法正確地鑒定出。BACTEC MGIT－960快速培養(yǎng)儀具有美國FDA認證的一線抗結核藥物藥敏試驗，在發(fā)達國家通常作為標準方法，但其吡嗪酰胺耐藥性測定需要專用的培養(yǎng)基和配套試劑，費用特別昂貴，價格幾乎相當于其他4種一線藥物的總和，限制了它的推廣應用。因此，快速、簡便、靈敏的吡嗪酰胺耐藥性測定技術研究是國內外學者所關注的課題，為了更好的指導臨床對吡嗪酰胺的使用，有必要研究開發(fā)一種準確、快速、廉價的吡嗪酰胺藥敏試驗方法。國內匡鐵吉教授在20世紀80年代研制的匡氏瓊脂培養(yǎng)基吡嗪酰胺藥敏試驗，能在3周左右報告結果，與酸羅氏法符合率為100%［4]；上海市結核重點實驗室研究了吡嗪酰胺耐藥性Mtb的噬菌體檢測技術，可以在3d內報告結果，與酸羅氏法比較準確性達到91.7［9]，因對比方法的不同，本研究未與上述方法進行比較。

建立Mtb的吡嗪酰胺耐藥性的方法，必須解決2個關鍵問題，一是吡嗪酰胺作用所需的酸性環(huán)境與Mtb在酸性環(huán)境下生長不良的問題，二是如何快速簡便指示細菌生長。本研究使用的手工操作的顆粒顯色指示液體培養(yǎng)系統(tǒng)，通用液體培養(yǎng)基含有營養(yǎng)豐富Middlebrook7H9營養(yǎng)肉湯和牛血清白蛋白、觸酶、多肽等特殊營養(yǎng)成分，并且使用0.1mol的鹽酸調節(jié)pH至6.0～6.1之間，可以很好地解決Mtb生長和吡嗪酰胺作用的問題。細菌生長指示管（BGIT），采用新型的氧化還原反應顯色指示劑，當有活的Mtb存在，則顆粒還原為紫紅色，顯色快，長時間保持顏色穩(wěn)定不變，大大提高了結果的可靠性，具有簡便、快速、準確的優(yōu)點，可為臨床及時提供結果。本研究中顆粒顯色指示法最早報告結果的時間比BACTEC MGIT－960法稍晚一天左右，主要集中在第8、9、10天出結果，二者的生長速度經統(tǒng)計學分析差異無統(tǒng)計學意義，而且其耗材成本略高于酸羅氏法而遠遠低于BACTEC MGIT－960法?？傊?，本研究利用顆粒顯色指示法檢測Mtb臨床分離株對吡嗪酰胺的耐藥性，跟BACTEC MGIT－960法比較，有較高的敏感度和特異度，結果報告時間差異無統(tǒng)計學意義，是一種快速、敏感、操作簡便，與標準方法符合率高的藥敏試驗方法。鑒于實驗例數(shù)較少，筆者期盼著通過不同研究者的反復論證和不同實驗室的反復試驗，最終能為吡嗪酰胺的耐藥性提供一種快速檢測手段。

［1] Blanchard JS.Molecular mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis.Annu Rev Biochem，1996，65：215－239.

［2] Lu PL，Lee YW，Peng CF，et al.The decline of high drug resistance rate of pulmonary Mycobacterium tuberculosis isolates from a southern Taiwan medical centre，1996—2000.Int J Antimicrob Agents，2003，21（3）：239－243.

［3] 金嘉琳，翁心華.分枝桿菌對吡嗪酰胺耐藥機制的研究進展.國外醫(yī)學微生物學分冊，2004，27（3）：31－33.

［4] 王金河，裴寧，匡鐵吉，等.結核分枝桿菌吡嗪酰胺敏感試驗方法的比較研究.第三軍醫(yī)大學學報，2004，26（10）：932－933.

［5] Zhang Y，Scorpio A，Nikaido H，et al.Role of acid pH and deficient efflux of pyrazinoic acid in unique susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide.J Bacteriol，1999，181（7）：2044－2049.

［6] Scorpio A，Lindholm－Levy P，Heifets L，et al.Characterization of pncA mutations in pyrazinamide－resistant Mycobacterium tuberculosis.Antimicrob Agents Chemother，1997，41（3）：540－543.

［7] Salfinger M，Heifets LB.Determination of pyrazinamide MICs for Mycobacterium tuberculosis at different pHs by the radiometric method.Antimicrob Agents Chemother，1988，32（7）：1002－1004.

［8] 敖軍平，陳季武，習兵霞，等.結核分枝桿菌耐吡嗪酰胺機制研究進展.國外醫(yī)藥抗生素分冊，2006，27（3）：97－99.

［9] 敖軍平，陳季武，胡忠義，等.吡嗪酰胺耐藥性結核分枝桿菌的噬菌體檢測技術研究.中華結核和呼吸雜志，2006，29（9）：625－628.