高古羅糖醛酸含量的萱藻（Scytosiphon lomentarius）多糖細(xì)微結(jié)構(gòu)研究

吳建東, 于廣利, 王培培, 趙 峽, 楊 波, 臺(tái)文靜

（中國海洋大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院 糖科學(xué)與糖工程實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003）

高古羅糖醛酸含量的萱藻（Scytosiphon lomentarius）多糖細(xì)微結(jié)構(gòu)研究

吳建東, 于廣利, 王培培, 趙 峽, 楊 波, 臺(tái)文靜

（中國海洋大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院 糖科學(xué)與糖工程實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003）

將青島產(chǎn)幼生和成熟期萱藻（Scytosiphon lomentarius）提取分離得到多糖, 經(jīng)1H-NMR分析, 表明其為高古羅糖醛酸含量的褐藻膠, 在對(duì)其G/M值分析基礎(chǔ)上, 進(jìn)一步對(duì)其二糖嵌段FMM, FMG, FGM, FGG和三糖嵌段FGGG, FGGM, FMGM, FMGG含量進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明, 幼生和成熟期萱藻除了總糖含量不同外, 其褐藻膠細(xì)微結(jié)構(gòu)也有顯著差別。幼生與成熟期萱藻中G/M分別為4.34和7.14, FGG含量分別為73%和84%, FGGG含量分別為68%和81%。成熟期萱藻中高含量多聚古羅糖醛酸是一種值得開發(fā)的多糖資源。

萱藻（Scytosiphon lomentarius）多糖; 聚古羅糖醛酸; 細(xì)微結(jié)構(gòu)

褐藻膠（Alginate）是由甘露糖醛酸（Mannuronic acid, M）和古羅糖醛酸（Guluronic acid, G）組成的嵌段水溶性高分子, 主要來源于褐藻細(xì)胞壁, 由于其結(jié)構(gòu)與藻種、產(chǎn)地以及生長季節(jié)有關(guān), 使得褐藻膠細(xì)微結(jié)構(gòu)差別很大。作為一種安全的生物功能高分子, 雖然褐藻膠在食品和化工中得到廣泛應(yīng)用, 但作為藥物開發(fā), 其細(xì)微結(jié)構(gòu)研究十分重要[1-4], 為了獲得高含量甘露糖醛酸或者古羅糖醛酸的褐藻膠, 國內(nèi)外一致從事褐藻新資源研究。

萱藻（Scytosiphon lomentarius）是我國沿海常見的藻種, 在山東半島和遼東半島廣泛分布, 產(chǎn)量較小。但國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)其中的部分活性成分進(jìn)行了研究, 如Demirel等[5]發(fā)現(xiàn)愛琴海產(chǎn)萱藻的二氯甲烷提取物有較強(qiáng)的抗氧化活性, 徐年軍等[6]發(fā)現(xiàn)萱藻的水提物能選擇性抑制 L1210活性, 徐秀麗等[7]發(fā)現(xiàn)萱藻的甲醇提取物對(duì)B 淋巴細(xì)胞增殖有較好的抑制活性和免疫抑制活性。在萱藻多糖研究方面, 劉志峰等[8]從萱藻中提取一種硫酸多糖, 發(fā)現(xiàn)其具有較好的抗凝血效果。關(guān)于萱藻中其他多糖的結(jié)構(gòu)研究未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

萱藻（Scytosiphon lomentarius）, 產(chǎn)地為青島, 分別于2008年2月和6月采于青島海邊, 藻種均經(jīng)中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院宮相忠副教授鑒定。

各種葡聚糖系列分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品（788, 404, 212,112, 47.3, 22.8和5.9 ku）購于日本Shodex公司; 乙醇、丙酮和鹽酸等常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。

PL aquagel-OH mixed不銹鋼色譜柱（30 cm×7.5 mm×8 μm, 美國 Perkin Elmer公司）; 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R401型, 瑞典 BUCHI公司）; 高效液相色譜儀（LC-20AD, 日本島津公司）; 紅外光譜儀（Nicolet Nexus 470型, Thermo Electron公司）; 核磁共振波譜儀（JNM-ECP600, 日本理光）; 紫外可見分光光度計(jì)（UV-2102 PCS, 尤尼柯公司）; 冷凍干燥儀（EZ50, 美國FTS公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖的提取[9]

萱藻經(jīng)水洗、烘干、粉碎后用乙醇脫脂, 經(jīng)碳酸鈉加熱提取后精制, 分別獲得幼生和成熟萱藻多糖。

1.2.2 分子量測定[10]

采用 HPGPC法測定多糖分子質(zhì)量。使用 PL aquagel-OH mixed不銹鋼色譜柱; 流動(dòng)相為0.2 moL/L NaNO3水溶液, 柱溫35℃, 流速0.5 mL/min,示差檢測器。將已知分子質(zhì)量的葡聚糖系列標(biāo)準(zhǔn)品及多糖樣品用流動(dòng)相配成5 g/L的溶液, 以標(biāo)準(zhǔn)多糖分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（logMw）對(duì)保留時(shí)間（tR）作圖, 得標(biāo)準(zhǔn)曲線（logMw=14.8636?0.6837tR;R2=0.998）, 計(jì)算多糖相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.3 紅外光譜（IR）分析[11]

樣品用P2O5干燥48 h, 取1～2 mg經(jīng)KBr壓片,測定紅外光譜, 掃描范圍為400～4 000 cm–1。

1.2.4 1H-NMR分析

參照Grasdalen等[12-13]方法, 將樣品用稀鹽酸輕微解聚, 即0.1%水溶液, pH 3,于100 ℃水解1 h。將水解液中和, 旋轉(zhuǎn)濃縮, 40 ℃氮吹儀吹干, D2O交換3次, 在超導(dǎo)核磁共振波譜儀（ECP 600 MHz）于80 ℃測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖的提取

萱藻用水洗去鹽類、泥沙等雜質(zhì), 曬干后40 ℃烘干至恒重, 粉碎, 過40目篩。萱藻碎沫加入10 V 85%乙醇, 80 ℃水浴脫脂4 h, 重復(fù)操作3次, 離心,殘?jiān)?0 ℃烘干。脫脂海藻加入10 V蒸餾水, 80 ℃攪拌提取4 h, 離心, 重復(fù)操作3次。水提后的藻體殘?jiān)? 40 ℃烘干后, 加入10 V的2 % Na2CO3溶液80 ℃提取4 h, 離心, 重復(fù)操作3次。合并濾液, 用4 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 8。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮, 加入95%乙醇使其終濃度達(dá)到30%, 4 ℃靜置過夜, 離心取沉淀。將沉淀溶解, 用 30%的乙醇重新醇沉, 沉淀依次用無水乙醇和丙酮脫水, 40 ℃烘干, 得幼生萱藻多糖（ISA）和成熟萱藻多糖（MSA）。

經(jīng)HPGPC測定ISA和MSA得相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）分別為86 ku和50 ku。

2.2 萱藻褐藻膠細(xì)微結(jié)構(gòu)研究

褐藻膠是由β-1,4-D-甘露糖醛酸（M）和α-1,4-L-古羅糖醛酸（G）組成, 分子中含有均聚M、均聚G以及雜聚MG 3種嵌段結(jié)構(gòu)。甘露糖醛酸和古羅糖醛酸殘基是 C5差向異構(gòu)體, 結(jié)構(gòu)上只有羧基位置不同,但是它們的構(gòu)型和化學(xué)性質(zhì)有著非常大的差別。甘露糖醛酸是4C1構(gòu)型并以平伏鍵連接; 而古羅糖醛酸是1C4構(gòu)型以豎直鍵相連接。聚甘露糖醛酸結(jié)構(gòu)具有柔性, 但聚古羅糖醛酸具有一定剛性, 這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有不同的作用。

經(jīng)過IR（圖略）分析表明, 2種多糖是褐藻膠且古羅糖醛酸含量較高。采用1H-NMR（圖1）可以精確地表征褐藻膠中單糖組成及其雙聚（GG, GM, GM, MM）和三聚嵌段（GGG, GGM, MGM, MGG）含量, 從而反映出褐藻膠的嵌段細(xì)微結(jié)構(gòu), 為其構(gòu)效關(guān)系研究提供理論依據(jù)。經(jīng)過分析表明, 萱藻中褐藻膠主要是多聚古羅糖醛酸, 5.02 為異頭碳H1信號(hào), 4.4 為均聚GG的H5信號(hào)峰; 當(dāng)G兩邊均相鄰M時(shí)其化學(xué)位移為 4.73, 當(dāng) G兩邊分別相鄰 G和 M 時(shí)其化學(xué)位移為 4.75; 均聚 M 的異頭碳質(zhì)子信號(hào)為4.62, 當(dāng)M與G相連時(shí)其化學(xué)位移為4.65。

圖1 幼生與成熟萱藻褐藻膠1H-NMR圖譜Fig. 1 1H-NMR spectra of alginates from immature （A） and mature （B）Scytosiphon lomentarius

從圖 1可知, 幼生和成熟萱藻褐藻膠中古羅糖醛酸含量均非常高。結(jié)合1H-NMR數(shù)據(jù)并根據(jù)Grasdalen的計(jì)算公式, 可以得到單糖FM和FG, 二糖FMM、FMG、FGM和 FGG以及相鄰三糖 FMGM、FMGG、FGGM、FGGG嵌段的摩爾比例, 相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。由表1可知,幼生和成熟期萱藻的FG含量均很高, 均大于0.8, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于報(bào)道過的海帶和馬尾藻（FG=0.35～0.45）[14-15];成熟萱藻中 GG和 GGG的比例明顯大于幼生萱藻,而M含量明顯變小, 特別是GGM和MGG的比例較低, 說明均聚G段比例高而雜合M的比例小。由于兩種多糖中的均聚 G含量都很高, 和二價(jià)金屬離子結(jié)合能力強(qiáng), 凝膠強(qiáng)度大, 該特點(diǎn)不僅適合于去除有毒金屬離子, 而且在含鈣食品中有特殊用途。高聚古羅糖醛酸含量多糖是一種性能優(yōu)良的生物材料,將在食品、醫(yī)藥和印染行業(yè)中有很大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值[14～17]。

表1 幼生和成熟期萱藻褐藻膠精細(xì)結(jié)構(gòu)比較Tab. 1 Comparison of fine structures of alginates from immature and maturedScytosiphon lomentarius

2.3 褐藻膠嵌段分布研究[18-19]

由于褐藻膠是嵌段化合物, 所以多采用嵌段分布參數(shù)η來表征G和M的嵌段分布情況, 即η=FMG/（FM×FG）。η值的意義為 0≤η＜1, 表示M,G排列以均聚嵌段為主;η=1, 表示M,G排列為無規(guī)序列; 1＜η≤2,表示M,G排列為交替嵌段為主。通過比較η值的大小, 即可得到兩種萱藻褐藻膠中M, G的結(jié)構(gòu)信息。由公式可得, ISA和MSA的η值分別為0.52和0.38。結(jié)果表明, 不同時(shí)期萱藻褐藻膠皆為均聚嵌段結(jié)構(gòu),成熟期均聚程度明顯高于幼稚期, 是一種理想的均聚古羅糖醛酸資源。

3 結(jié)論

以青島產(chǎn)兩種不同生長期的萱藻為材料并從中提取多糖, 通過1H-NMR方法確定其為褐藻膠, 并進(jìn)一步測定了其單糖組成及其細(xì)微結(jié)構(gòu), 表明萱藻多糖是一種高古羅糖醛酸含量的褐藻膠, 而且隨著萱藻的成熟, G含量顯著增加并高達(dá)88%, 這是目前發(fā)現(xiàn)的天然海藻中聚古羅糖醛酸含量最高的藻種。該發(fā)現(xiàn)為以萱藻為原料直接提取高含量和高分子質(zhì)量聚古羅糖醛酸提供了依據(jù), 也為萱藻的大規(guī)模養(yǎng)殖, 以及對(duì)該藻種進(jìn)行品種改良提供了重要參考。

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Received: Jan., 27, 2010

Key words:Scytosiphon lomentariuspolysaccharide; polyguluronic acid; fine structure

Abstract:The guluronic acid- rich alginate, extracted from immature and matureScytosiphon lomentarius,were studied by1H-NMR. Based on the G/M ratio analysis, the disaccharide fragments （FMM, FMG, FGM, and FGG） and trisaccharide fragments （FGGG,FGGM,FMGMand FMGG） were further analyzed with1H-NMR, respectively. The result shows that the total contents of guluronic acid and the fine structure of polysaccharides in immature and matureS.lomentariuswere different. The G/M ratio were 4.34 and 7.14, FGGratio 0.73 and 0.84, and the FGGGratio 0.68 and 0.81 in the immature and matureS. lomentarius, respectively. The matureS. lomentariusthat has a high content of polyguluronic acid is a good resource for polysaccharide extraction.

（本文編輯:康亦兼）

Fine structures of guluronic acid-rich aliginate from Scytosiphon lomentarius

WU Jian-dong, YU Guang-li, WANG Pei-pei, ZHAO Xia, YANG Bo, TAI Wen-jing

（School of medicine and Pharmacy, Ocean University of China, Qingdao 266003,China）

Q949.28+8.3; R282.77

A

1000-3096（2011）01-0040-04

2010-01-27;

2010-05-25

國際合作項(xiàng)目（2007DFA30980）; 國家自然基金項(xiàng)目（30870506）

吳建東（1985-）, 男, 山東文登人, 碩士研究生, 研究方向:海洋糖藥物; 于廣利, 通信作者, 電話: 0532-82031560; E-mail:glyu@ouc.edu.cn