王 健， 孫 玉 梅， 王 培 忠， 曹 方

( 大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034 )

0 引 言

經(jīng)過一次、二次常規(guī)采油之后，遺留在地層的殘余油仍然占石油總量的60%～70%。如何最大限度地開采出地下剩余的原油，已經(jīng)成為石油工業(yè)的重要任務(wù)。Zobell在1946年發(fā)表了利用微生物提高石油采收率的專利，并發(fā)現(xiàn)微生物提高石油采收率的機(jī)理之一是微生物代謝過程中產(chǎn)生了生物表面活性劑[1-2]。產(chǎn)生表面活性劑的微生物種類很多，如酵母菌、真菌、細(xì)菌等。能以原油組分為碳源和能源產(chǎn)生生物表面活性劑的微生物，是微生物采油的首選菌種?，F(xiàn)已知的能應(yīng)用于微生物采油的菌種有近30個屬100多種。利用不同的培養(yǎng)基對不同的菌種進(jìn)行培養(yǎng)、馴化，獲得了可以產(chǎn)生大量表面活性劑、對稠油具有較強(qiáng)的分散、乳化作用的菌種[3]。從污水中分離到的一株地衣芽孢桿菌可以耐受高溫和高濃度鹽，且對原油具有較強(qiáng)的乳化、增溶和降黏作用[4]。Ghojavand等[5]在兼性厭氧條件下篩選出耐高溫(60 ℃)、高礦化度(15%NaCl)的枯草芽孢桿菌，該菌對原油具有較強(qiáng)的降黏作用。研究生物表面活性劑產(chǎn)生菌在微生物采油過程中的生長規(guī)律，探討其作用機(jī)理，對微生物采油技術(shù)的改進(jìn)和完善具有十分重要的理論和實際意義[6]。本研究通過原油平板培養(yǎng)法，篩選出3株生物表面活性劑產(chǎn)生菌，對各菌株進(jìn)行生理生化試驗和初步鑒定；測定各菌株在發(fā)酵過程中發(fā)酵液表面張力、pH、菌體密度和細(xì)胞疏水性等特征參數(shù)；對各菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑組成進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 源

盤錦油田被原油污染的土壤。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基及其制備方法

液體富集培養(yǎng)基(g/L)：原油3.0，NaCl 3.0，NH4Cl 0.1，MgSO40.02，NaNO30.2，KH2PO40.1，K2HPO40.2，pH 7.0。于1.03×105Pa滅菌30 min。

平板富集培養(yǎng)基(g/L)：原油3.0，蛋白胨5.0，瓊脂20.0，NaCl 3.0，NH4Cl 0.1，MgSO40.02，NaNO30.2，KH2PO40.1，K2HPO40.2，pH 7.0。于1.03×105Pa滅菌30 min。

平板分離及保藏培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖3.0，蛋白胨8.0，酵母膏3.0，KH2PO42.7，NaCl 5.0，瓊脂20.0，pH 7.0。于0.8×105Pa滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5.0，牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，pH 7.0，于1.03×105Pa滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO43.4，Na2HPO41.5，(NH4)2SO44.0，MgSO4·7H2O 0.7，酵母粉0.2，液體石蠟17，pH 7.0，于1.03×105Pa滅菌30 min。

1.2.2 菌源微生物的富集

稱取土樣10 g，加入生理鹽水90 mL，振蕩均勻，靜止12 h。取上清液按10%接種量接種到液體富集培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)3 d。連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3次。

1.2.3 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離、篩選與鑒定

生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離、初篩：將液體富集培養(yǎng)液用無菌生理鹽水稀釋105、106、107倍，每個稀釋度取0.1 mL菌液涂布于平板富集培養(yǎng)基上，于30 ℃靜置培養(yǎng)4 d。將平板富集培養(yǎng)基上有乳化圈或噬油斑[7]的菌落，進(jìn)一步在平板分離培養(yǎng)基上劃線分離純化，挑取單菌落保藏在斜面保藏培養(yǎng)基上。

生物表面活性劑產(chǎn)生菌的復(fù)篩：將斜面保存的初篩菌株接種在種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)1～3 d，再以體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量將種子培養(yǎng)液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)。根據(jù)液體石蠟被乳化及發(fā)酵液表面張力的變化，篩選出產(chǎn)生物表面活性劑的優(yōu)勢菌株。

生物表面活性劑產(chǎn)生菌的鑒定：根據(jù)《伯杰氏(Berge)菌種鑒定手冊》對分離得到的部分菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化鑒定。

1.2.4 生物表面活性劑提取與分析

1.2.4.1 生物表面活性劑的提取

將發(fā)酵液用濾紙過濾除油，濾液于3 000g離心20 min除菌，取上清液加入等體積的氯仿和甲醇(體積比為2∶1)的混合液，萃取3次。將萃取后的有機(jī)相于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得表面活性劑粗品[8]。

1.2.4.2 生物表面活性劑的化學(xué)組成分析

將發(fā)酵液用濾紙過濾除油，濾液于3 000g離心20 min除菌，取上清液加入等體積氯仿和甲醇(體積比為2∶1)萃取所得有機(jī)相進(jìn)行薄層層析。以氯仿、甲醇和水(體積比為65∶15∶2) 為展開劑，以苯酚-硫酸試劑為顯色劑，顯棕色斑點為糖脂；以茚三酮試劑為顯色劑，顯紅色斑點為脂肽。

取150 mg樣品加入2 mol/L H2SO4，于100 ℃密封水解8 h，用BaCO3中和至中性，3 000g離心10 min，取上清液進(jìn)行薄層層析。以氯仿、甲醇和水(體積比為65∶15∶2)為展開劑，以苯酚-硫酸試劑為顯色劑，以鼠李糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品[9]。

薄層層析用硅膠板為德國Merck公司產(chǎn)品silica gel 60 F254。

1.2.5 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生長特性

菌體密度的測定：采用濁度法[10]。移除發(fā)酵液上層油相，取發(fā)酵液3 mL，加入TritonX-100(0.2%)溶液0.5 mL ，漩渦振蕩1 min，于3 000g離心20 min，倒掉上清液，用3 mL去離子水重懸菌體，以去離子水為空白，于600 nm測定菌懸液的光密度OD600，以此表示發(fā)酵液的菌體密度。

疏水性(BATH)測定：采用BATH測定方法[10-11]。移除發(fā)酵液上層油相，取發(fā)酵液3 mL，測定OD′600。加入石油醚0.1 mL，振蕩1 min，靜置30 s，再振蕩1 min，于30 ℃水中靜置15 min，取下層液體測定OD600。細(xì)胞疏水性BATH=OD600/OD′600。

表面張力測定：采用JY-180表面張力儀(承德大華試驗機(jī)有限公司) 測定。將發(fā)酵液用濾紙過濾除油，濾液于3 000g離心20 min除菌，取上清液測定表面張力。

pH測定：采用pH3-3C精密pH計(上海雷磁儀器廠)測定。將發(fā)酵液用濾紙過濾除油，濾液于3 000g離心20 min除菌，取上清液測定pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選

經(jīng)富集分離共得到49株細(xì)菌，初步篩選出14株生長較好的目的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基。在微生物采油過程中，表面活性劑和有機(jī)酸可以把原油從巖層中剝離下來，提高原油流動性。因此，以發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH和表面張力的降低為指標(biāo)，對初篩得到的菌株進(jìn)行復(fù)篩，同時分析所產(chǎn)生物表面活性劑的類型，結(jié)果見表1。

表1 初篩菌株的發(fā)酵測定結(jié)果

由表1可知，菌株29#、30#、31#、37#、47#的發(fā)酵液的表面張力值及pH較低。選取該5株菌進(jìn)行分析，菌株29#、30#、31#發(fā)酵液的表面張力及pH比較接近，產(chǎn)生的生物表面活性劑均為糖脂，在原油平板上的菌落均為熒光綠色，種子液和發(fā)酵液均為熒光綠色，細(xì)胞均為桿狀且大小相同。因此，判斷該3株菌為同一菌種。復(fù)篩得到的菌株為31#、37#、47#。

2.2 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生理生化特性

對篩選所得菌株進(jìn)行常規(guī)生理生化特性實驗，結(jié)果如表2所示。根據(jù)表2所示結(jié)果和《伯杰氏(Berge)菌種鑒定手冊》的描述，可鑒定菌株31#為假單孢屬，菌株37#、47#均為芽孢桿菌屬。

表2 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生理生化特性

2.3 生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生長特性

2.3.1 菌株31#的生長特性

菌株31#的生長特性如圖1所示。在發(fā)酵前48 h，菌株31#細(xì)胞疏水性呈上升趨勢，菌體密度逐步增長，發(fā)酵液的表面張力下降。表明較強(qiáng)的細(xì)胞疏水性能增加菌體對疏水性有機(jī)物的吸附，從而增加菌體與有機(jī)物的接觸機(jī)會，增強(qiáng)對有機(jī)物的利用能力，導(dǎo)致菌體大量生長并產(chǎn)生大量的生物表面活性物質(zhì)，使發(fā)酵液的表面張力大幅度下降，產(chǎn)生的生物表面活性物質(zhì)通過改變吸附界面的特性來調(diào)節(jié)細(xì)胞與界面之間的親和力，進(jìn)一步促進(jìn)微生物細(xì)胞對烴類化合物的附著和烴類化合物穿透細(xì)胞膜間隙[12-13]。在發(fā)酵48～84 h期間，菌體生長進(jìn)入衰亡期，細(xì)胞疏水性下降，發(fā)酵液的表面張力呈下降趨勢，這是部分菌體自溶釋放出細(xì)胞內(nèi)的生物表面活性物質(zhì)的結(jié)果[14]。在發(fā)酵84～108 h期間，細(xì)胞疏水性呈下降趨勢，發(fā)酵液的表面張力隨菌體密度增大而增大，表明菌體攝取烴類化合物能力降低，利用發(fā)酵液中積累的生物表面活性劑呈現(xiàn)二次生長。在發(fā)酵108～120 h期間，細(xì)胞疏水性上升，表面張力下降。由于31#為革蘭氏陰性菌，細(xì)胞外壁中存在與其疏水性密切相關(guān)的脂多糖，發(fā)酵液中大量積累的生物表面活性劑導(dǎo)致細(xì)胞壁中脂多糖大量流失，從而引起細(xì)胞疏水性增大[15]。

圖1 菌株31#的好氧培養(yǎng)過程曲線

Fig.1 Cultivation course curve of strain 31#under aerobic condition

2.3.2 菌株37#的生長特性

菌株37#的生長特性如圖2所示。在發(fā)酵過程中，細(xì)胞疏水性總體呈上升趨勢。發(fā)酵24 h時，細(xì)胞疏水性大于1，菌體密度隨細(xì)胞疏水性的增大而增大。發(fā)酵36 h時，發(fā)酵液的表面張力降低，這是因為烴類的難溶性使得微生物在攝取烴類生長過程中往往伴隨著生物表面活性劑的生成，其主要作用是使烴類在水溶液中有效擴(kuò)散，并滲入細(xì)胞內(nèi)部被同化分解[16]，菌體能夠更好地利用烴類碳源生長，菌體密度上升。在發(fā)酵48～84 h期間，菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體密度保持不變。在發(fā)酵84～96 h期間，菌體密度上升，細(xì)胞出現(xiàn)二次生長。這是由于液體石蠟是一種混合物，菌體首先攝取較易利用的10個碳以上的長鏈烷烴[17]，然后再利用其他鏈長的烷烴進(jìn)行生長，同時因為細(xì)胞疏水性上升，細(xì)胞利用液體石蠟的能力增強(qiáng)，從而產(chǎn)生大量的生物表面活性物質(zhì)，使發(fā)酵液的表面張力下降。在發(fā)酵96～120 h期間，細(xì)胞疏水性的降低，菌體密度降低，菌體生長進(jìn)入衰亡期，發(fā)酵液的表面張力上升。

圖2 菌株37#的好氧培養(yǎng)過程曲線

Fig.2 Cultivation course curve of strain 37#under aerobic condition

2.3.3 菌株47#的生長特性

菌株47#的生長特性如圖3所示。在發(fā)酵前48 h，菌體密度顯著增長，細(xì)胞疏水性增大，發(fā)酵液的表面張力降低。在發(fā)酵60～72 h期間，菌體密度減小，細(xì)胞疏水性降低，發(fā)酵液表面張力降低，菌體生長進(jìn)入衰亡期。在發(fā)酵72～84 h期間，菌體密度增加，細(xì)胞出現(xiàn)二次生長，產(chǎn)生大量的生物表面活性物質(zhì)，使發(fā)酵液的表面張力大幅下降。在發(fā)酵84～120 h期間，菌體密度降低，發(fā)酵液的表面張力在保持一段時間的基本穩(wěn)定后升高。表明菌體在利用烴類生長過程中，產(chǎn)生了生物表面活性劑。生物表面活性劑的產(chǎn)生降低了油水界面張力，使烷烴得以有效擴(kuò)散，增大油水界面面積，從而便于細(xì)胞與較大油滴之間的直接接觸，同時使細(xì)胞的疏水性變大，導(dǎo)致細(xì)胞親油，從而有利于菌對烴類的利用[18]。

圖3 菌株47#的好氧培養(yǎng)過程曲線

Fig.3 Cultivation course curve of strain 47#under aerobic condition

2.4 生物表面活性劑的化學(xué)組分分析

將菌株31#、37#和47#于30 ℃培養(yǎng)后，對發(fā)酵液萃取所得生物表面活性劑粗制品進(jìn)行硅膠薄層層析，結(jié)果如圖4所示。將萃取所得生物表面活性劑粗制品進(jìn)行酸解，硅膠薄層層析結(jié)果如圖5所示。

圖4的層析結(jié)果顯棕色，說明菌株31#、37#和47#所產(chǎn)的生物表面活性劑均為糖脂。由圖5可知，菌株31#、37#和47#所產(chǎn)的生物表面活性劑經(jīng)酸解后顯棕色斑點，且Rf值與鼠李糖的Rf值相同，說明菌株31#、37#和47#所產(chǎn)的生物表面活性劑的糖基均為鼠李糖。

圖4 生物表面活性劑粗品的TLC圖譜

圖5 生物表面活性劑酸解后的TLC圖譜

Fig.5 Thin-layer chromatography of biosurfactant hydrolyzed by acid

3 結(jié) 論

通過對發(fā)酵液表面張力及pH的測定，篩選出3株生物表面活性劑產(chǎn)生菌，且所產(chǎn)的生物表面活性劑均為鼠李糖脂；經(jīng)生理生化鑒定，菌株31#為假單胞菌屬，菌株37#、47#為芽孢桿菌屬；通過對所篩菌株的生長特性的研究，說明菌體密度、細(xì)胞疏水性、發(fā)酵液的pH及表面張力之間密切相關(guān)，相互制約。在以液體石蠟為唯一碳源培養(yǎng)時，菌株31#的發(fā)酵液表面張力下降最多，且表現(xiàn)出的細(xì)胞疏水性最強(qiáng)，發(fā)酵液表面張力下降到49.47 mN/m，細(xì)胞疏水性為3.09%。較強(qiáng)的細(xì)胞疏水性有利于菌體對疏水性基質(zhì)的利用，從而導(dǎo)致菌體密度的增長及發(fā)酵液表面張力的下降，這對微生物開采稠油十分有利。

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