李 愛 民， 叢 麗 娜， 侯 英 敏

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

目前在微生物產(chǎn)生活性物質(zhì)的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)從陸地上尋找新的菌種和活性物質(zhì)的幾率越來越小，尋找活性物質(zhì)成為當務(wù)之急。海洋蘊藏著極其豐富的微生物資源，特殊的生活環(huán)境、生態(tài)系統(tǒng)使其代謝產(chǎn)物具有很多新穎的結(jié)構(gòu)和令人驚喜的生物活性。因此，海洋微生物作為一個巨大的尚未開發(fā)的資源越來越受到關(guān)注。海洋細菌是海洋微生物中的優(yōu)勢類群，同時具有產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的巨大潛力，無疑成為藥物篩選的重要來源，是目前國際研究的熱點[1-3]。

近年來,很多人對海洋中多種動植物的共附生微生物及其代謝產(chǎn)物進行了研究[4]。迄今為止，許多科學(xué)家已從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)了許多具有不同生物學(xué)活性的物質(zhì),包括毒素、抗生素、抗腫瘤活性物質(zhì)、酶類、色素等[5]。本課題組從大連海域的野生海參體內(nèi)分離篩選到一株具有抗菌活性的海洋細菌HS-A38菌株，對HS-A38菌進行生理生化特征的測定，并對其16S rDNA序列進行分析，最后對HS-A38菌株的發(fā)酵條件進行了初步研究，旨在為該海洋細菌的應(yīng)用開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗材料

海洋細菌HS-A38菌株分離自大連海域生長的野生海刺參腸樣品，該菌株由本實驗室保存。

生物活性指示菌株：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtili)、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)、志賀菌(Shigellaspp)、 大腸桿菌(Escherichiacoli)、副溶血性弧菌(Vibrioparachaemolyticus)，均由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基(2216E)：蛋白胨 5 g，酵母膏1 g，磷酸高鐵0.01 g，瓊脂15～20 g，陳海水1 L，用煮沸氫氧化鈉(5%)的溶液調(diào)pH值7.6～7.8。用于海洋細菌菌株的分離與形態(tài)學(xué)特征觀察。

發(fā)酵培養(yǎng)基(BPY)：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，氯化鈉5 g，葡萄糖5 g，自來水1 L。用于生長條件測試的液體培養(yǎng)基。

1.2 方 法

1.2.1 海參腸道菌株的分離純化

在無菌條件下將海參腸取出放進研缽進行研磨，取少量研磨后的液體涂布到2216E培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)4～6 d。對2216E培養(yǎng)基平板上生長出的菌落進行多次劃線分離，確保不含雜菌。采用組織印跡法[2]進行滅菌效果的檢驗，即檢查海參表皮是否有細菌。將分離出的HS-A38菌株保存在4 ℃、2216E斜面培養(yǎng)基上。

1.2.2 菌株發(fā)酵液抗菌活性的測定

將菌株HS-A38接種至BPY液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min，培養(yǎng)2 d。發(fā)酵液離心(10 000 r/min) 5 min，上清液用 0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌。采用管碟法測定抗菌活性，即將牛津杯分別貼放在涂有指示菌的平板上，以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、溶壁微球菌、志賀菌、大腸桿菌以及副溶血性弧菌作為指示菌，牛津杯中加入過濾除菌的發(fā)酵液 100 μL，滴加無菌發(fā)酵液作空白對照。37 ℃培養(yǎng) 24 h 后，用游標卡尺測定抑菌圈直徑，做3次平行試驗，取平均值。

1.2.3 形態(tài)學(xué)特征與生理生化特征

將菌株HS-A38在2216E培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)2～3 d后，觀察菌落形態(tài)。挑取菌體涂片，革蘭氏染色后用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)。參照《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》與第8版《伯杰細菌鑒定手冊》中方法進行生理生化實驗。

1.2.4 16S rDNA基因序列測定及進化樹構(gòu)建

將菌株HS-A38接種在無菌的平板上，30 ℃培養(yǎng)過夜，取單菌落懸浮于50 μL無菌蒸餾水中，100 ℃水浴5 min，離心，取上清液作為細菌DNA原液。采用任世英等[6]的方法進行PCR，正向引物Primer A： 5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，反向引物Primer B：5′-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3′。PCR產(chǎn)物純化后委托大連寶生物公司測定DNA序列。將測定的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對。采用Clustal W軟件進行多序列匹配排列，然后用 MEGA 3.1軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 菌株生長曲線繪制

將保存的HS-A38斜面菌種在2216E培養(yǎng)基活化培養(yǎng)48 h后，接一環(huán)到BPY培養(yǎng)基(100 mL三角瓶中裝液10 mL)，置30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，以5%的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 ℃、180 r/min條件下，振蕩培養(yǎng)72 h。每4 h取樣1次，采用比濁法測定菌量并繪制生長曲線；另外，每8 h取樣1次，采用平板稀釋法測定活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參腸道菌株分離

按照菌落形態(tài)、大小、色澤等不同，從海參腸道內(nèi)分離出82株細菌。用瓊脂塊法初篩，從分離到的82株細菌中篩選出16株拮抗菌株，占總分離菌株數(shù)的19.5%，抗革蘭氏陽性菌的拮抗菌株有14株，占拮抗細菌總數(shù)的87.5% ；而抗革蘭氏陰性菌的菌株有2株，占拮抗細菌總數(shù)的12.5%。其中有2株菌株能同時抗革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。對初篩的菌株用液體發(fā)酵的方法再次進行抑菌篩選以期能篩選出抑菌能力較穩(wěn)定、較強的菌株。篩選出HS-A38菌株有穩(wěn)定、較強的抑菌活性。

2.2 HS-A38菌株發(fā)酵液的抑菌活性

采用牛津杯擴散法對菌株HS-A38的發(fā)酵液進行抑菌譜實驗。抗菌活性結(jié)果表明，該菌株對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、志賀菌、枯草芽孢桿菌和溶壁微球菌均有很強的抑制作用，并且對革蘭氏陰性菌大腸桿菌和副溶血性弧菌也具有較好的抑菌作用 (表1)。

表1 菌株HS-A38發(fā)酵液的抑菌活性

2.3 形態(tài)觀察及生理生化特征

菌株 HS-A38 在2216E固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24 h 后，單菌落形狀為圓形，表面光滑，隆起，半透明，乳白色，有一定黏度。菌體革蘭氏染色陽性，細胞有芽孢，可運動。常規(guī)生理生化鑒定結(jié)果表明,菌株HS-A38為葡萄糖發(fā)酵型, 接觸酶和淀粉水解檢測呈陽性，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。根據(jù)其菌落形態(tài)、生長特性及生理生化特征,菌株 HS-A38 為芽孢桿菌屬中一員,見圖1。

圖1 HS-A38在油鏡下的形態(tài)

2.4 16S rDNA序列分析

通過對菌株HS-A38的16S rDNA擴增，測得其序列長度為1 468 bp。該序列已提交至GenBank，其檢索號為GQ 466597。將該菌株的16S rDNA序列在GenBank BLAST中進行同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與6個枯草芽孢桿菌和3個解淀粉芽孢桿菌的相應(yīng)序列具有100%的同源性。從系統(tǒng)發(fā)育樹上(圖2)也明顯看出，菌株HS-A38與枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌聚成一支。但由于解淀粉芽孢桿菌一般是從豆科發(fā)酵物中分離得到，而枯草芽孢桿菌的分離來源廣泛，其中包括從土壤、海洋動物和植物組織中等。因此，綜上菌體形態(tài)和生理生化特征分析以及16S rDNA序列分析，可以認為菌株HS-A38為枯草芽孢桿菌。

圖2 HS-A38系統(tǒng)發(fā)育樹(括號內(nèi)為序列登錄號)

3 結(jié) 論

通過對海參腸道內(nèi)細菌分離，篩選出一株菌株(HS-A38)，該菌株形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征與芽孢桿菌屬相符。對菌株HS-A38的16S rDNA擴增，測得其序列長度為1 468 bp，該序列已提交至GenBank(檢索號為GQ 466597)，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可認為菌株HS-A38為枯草芽孢桿菌。該菌株對副溶血弧菌和大腸桿菌等有較強的抑菌作用，并且該菌具有適應(yīng)海洋環(huán)境、較短的生長周期，具有開發(fā)益生菌制劑的潛力。

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