顧 艷 麗， 張 慧， 劉 賽 男， 李 憲 臻

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

近年來，堿性蛋白酶作為工業(yè)催化劑得到廣泛使用。與傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑相比，堿性蛋白酶具有催化能力強(qiáng)、底物專一性高等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于制革、銀回收、醫(yī)藥、食品、飼料、化學(xué)工業(yè)、廢物處理等生產(chǎn)及行業(yè)[1]，尤其是作為無磷洗衣粉的添加劑使用，已使堿性蛋白酶商業(yè)制劑的銷售占整個(gè)蛋白酶市場的1/3以上，顯示出良好的使用性能和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但國產(chǎn)堿性蛋白酶己不能滿足洗滌劑工業(yè)發(fā)展的需求，大規(guī)模工業(yè)用堿性蛋白酶主要依賴于國外進(jìn)口。因此，尋找一種能分泌具有良好酶學(xué)特性并適用大規(guī)模洗滌劑工業(yè)生產(chǎn)的堿性蛋白酶高產(chǎn)菌種，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究在前期菌株篩選的基礎(chǔ)上對(duì)篩選出的產(chǎn)堿性蛋白酶菌株I13進(jìn)行產(chǎn)酶條件的響應(yīng)面[2]優(yōu)化，最終確定了該菌株較佳的產(chǎn)酶條件。

1 材料與方法

1.1 菌 株

實(shí)驗(yàn)室前期工作分離篩選獲得的保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g，酵母粉0.5 g，干酪素0.1 g，葡萄糖1 g，氯化鈉1 g， 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 10.5) 100 mL，滅菌后用5 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至10.5。

基本發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1 g，酵母粉1 g，氯化錳0.05 g，干酪素0.1 g，氯化鈉1 g，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 10.5) 100 mL，滅菌后用5 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至10.5。

1.3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：將實(shí)驗(yàn)室的保藏菌種接一環(huán)到種子培養(yǎng)基中，于20 ℃、160 r/min的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，取OD600=0.15的發(fā)酵液作為種子液。

發(fā)酵培養(yǎng)：取種子培養(yǎng)液以5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，20 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)36 h，離心取上清液即為粗酶液。

1.4 酶活力的測定方法

采用Folin-酚法測定堿性蛋白酶活力。將150 μL粗酶液和150 μL 2%酪蛋白的磷酸緩沖溶液(pH 10.5)40 ℃預(yù)熱3 min后混合，于40 ℃反應(yīng)10 min，立即加入0.4 mol/L三氯乙酸(TCA)300 μL終止反應(yīng)。于9 000 r/min離心10 min后取上清液300 μL，加入Na2CO31.5 mL、福林酚試劑300 μL，40 ℃顯色20 min，于722S分光光度計(jì)測OD680。以TCA滅活后的酶液作為對(duì)照。在40 ℃、pH 10.5條件下每分鐘催化水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.5 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選

采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法[2-4]和Minitab15數(shù)據(jù)處理軟件[5]創(chuàng)建試驗(yàn)次數(shù)N=12的試驗(yàn)，對(duì)葡萄糖(A)、酵母粉(B)、NaCl(C)、MnCl2(D)、溫度(F)、起始pH(G)、接種量(H)和裝液量(J)8個(gè)因素進(jìn)行考察，另設(shè)2個(gè)虛擬列(E、K)，以考察試驗(yàn)誤差，以酶活力為響應(yīng)值考察各因素對(duì)產(chǎn)酶影響的顯著性。

1.6 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡法[6]以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，建立有效的響應(yīng)面擬合方程。

1.7 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面分析法(RSM)中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)(Box-Behnken)是一種尋找多因素系統(tǒng)中最佳條件的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法。本試驗(yàn)利用Minitab15 數(shù)據(jù)處理軟件設(shè)計(jì)一個(gè)三因素三水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的試驗(yàn)，得到最佳的產(chǎn)酶條件，以提高酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選結(jié)果

根據(jù)前期單因素試驗(yàn)確定的最佳碳源、氮源等條件，選用試驗(yàn)次數(shù)N=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)10個(gè)因素(8個(gè)實(shí)際因素、2個(gè)虛擬因素)進(jìn)行考察，分別對(duì)應(yīng)于表1的10列，每個(gè)因素取2個(gè)水平，以堿性蛋白酶活力為響應(yīng)值。選擇置信度較高的因素作為顯著因素進(jìn)一步考察，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示，各因素主效應(yīng)分析結(jié)果如表2所示。

表1 篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的因素與水平

由表1、2可以看出，接種量、酵母粉和培養(yǎng)溫度這3個(gè)因素對(duì)酶活力影響極顯著，其他5個(gè)因素對(duì)酶活力影響顯著，所以將接種量、酵母粉和培養(yǎng)溫度這3個(gè)因素進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。由表2可看出，接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著正效應(yīng)，酵母粉和培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著負(fù)效應(yīng)。若要提高產(chǎn)酶量，應(yīng)該加大接種量，減少酵母粉濃度，降低培養(yǎng)溫度。而其他條件的取值根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小，正效應(yīng)的因素取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素取較低值。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

由Plackett-Burman篩選出的3個(gè)主要因素的效應(yīng)和大小比例設(shè)計(jì)其最陡爬坡路徑，其中接種量有顯著正效應(yīng)，應(yīng)增加；酵母粉和培養(yǎng)溫度有顯著負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減少。設(shè)計(jì)結(jié)果如表3所示。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

由表3可以看出，最優(yōu)產(chǎn)酶條件在試驗(yàn)3和試驗(yàn)5之間，故以試驗(yàn)4的條件為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.3.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及結(jié)果

以Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出的3個(gè)極顯著因素，結(jié)合最陡爬坡試驗(yàn)，選取試驗(yàn)4為中心點(diǎn)，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菌株I13的產(chǎn)酶活力進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，共12個(gè)析因點(diǎn)和3個(gè)區(qū)域中心點(diǎn)(零點(diǎn))。析因點(diǎn)是自變量取值在各因素所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，區(qū)域中心點(diǎn)用以估計(jì)試驗(yàn)。各參數(shù)所代表的因素及水平如表4所示。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平

利用Minitab15數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行分析，以酶活力為響應(yīng)值，經(jīng)二次多元回歸擬合，確定酶活力的預(yù)測值對(duì)酵母粉、溫度、接種量的二元多次回歸方程。試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 Box-Behnken設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

回歸方程為

Y=315.7+7.02A-9.31B+19.76C-

54.71A2-28.09B2-30.89C2-

0.23AB+0.61AC-0.83BC

對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，可得到3個(gè)方程：

7.02-109.42A-0.23B+0.61C=0

(1)

-9.31-0.23A-56.18B-0.83C=0

(2)

19.76+0.61A-0.83B-61.78C=0

(3)

聯(lián)立方程組(1)、(2)、(3)求解，得出模型的極值點(diǎn)：A=0.07，B=-0.16，C=0.32。產(chǎn)堿性蛋白酶菌株產(chǎn)酶的最優(yōu)理論條件為：酵母粉質(zhì)量濃度為10.2 g/L，溫度為14.68 ℃，接種量為5.32%。由回歸方程可以確定最大酶活力為321.34 U/mL。

2.3.2 二次回歸擬合及方差分析

由回歸系數(shù)的顯著性分析(表6)可知該模型是顯著的，回歸方程中C、A2、B2、C2對(duì)Y值影響極顯著，B對(duì)Y值的影響顯著，其他項(xiàng)的系數(shù)均不顯著，說明試驗(yàn)因子的線性和二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值都有很大關(guān)系，而交互項(xiàng)的影響相對(duì)較小。

表6 回歸系數(shù)顯著性分析

由方差分析結(jié)果(表7)可知，模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=97.29%，失擬項(xiàng)P=0.997，沒有顯著性的影響，說明二次回歸方程的擬合程度很好，失擬較小，不需引入更高次數(shù)的項(xiàng)。該模型可以用于產(chǎn)堿性蛋白酶菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化的理論預(yù)測。

表7 模型方差分析

2.3.3 響應(yīng)曲面及等高線分析

將表5的試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Minitab15分析軟件處理，繪制其響應(yīng)面曲線及等值線，見圖1～3。圖1～3直觀地給出了各個(gè)因子對(duì)酶活力影響的曲面圖及等高線圖，酵母粉、培養(yǎng)溫度和接種量都存在著相關(guān)性。圖1表明，當(dāng)接種量位于中心水平時(shí)，酵母粉和培養(yǎng)溫度對(duì)酶活力影響的交互作用較顯著，因?yàn)榈雀呔€的形狀反應(yīng)了交互作用的顯著性，等高線圖接近圓形則交互作用不顯著，等高線圖呈橢圓形則交互作用顯著。由曲面圖及等高線圖可以直觀看出酵母粉和培養(yǎng)溫度的交互作用較顯著。

圖1 酵母粉(A)和培養(yǎng)溫度(B)對(duì)酶活力影響的曲面圖及等高線圖

圖2 酵母粉(A)和接種量(C)對(duì)酶活力影響的曲面圖及等高線圖

圖3 接種量(B)和培養(yǎng)溫度(C)對(duì)酶活力影響的曲面圖及等高線圖

圖2是當(dāng)培養(yǎng)溫度位于中心水平時(shí)的交互作用較顯著，酵母粉和接種量對(duì)酶活力影響的曲面圖及等高線圖?？梢钥闯龅雀呔€圖呈橢圓形，交互作用較顯著。

圖3是當(dāng)酵母粉位于中心水平時(shí)，接種量和培養(yǎng)溫度對(duì)酶活力影響的曲面圖及等高線圖?？梢钥闯龅雀呔€圖呈圓形，交互作用不顯著。

2.3.4 最佳產(chǎn)酶條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

由求得的最優(yōu)回歸方程得到酶活力達(dá)到最大值時(shí)，酵母粉質(zhì)量濃度為10.2 g/L，溫度為14.68 ℃，接種量為5.32%，此時(shí)的最大酶活力為321.34 U/mL。為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，采取響應(yīng)面分析法求得的最佳條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn),結(jié)果得出酶活力分別為320.56、322.17、323.05 U/mL，均值為321.93 U/mL，與理論預(yù)測值基本吻合，平均誤差為0.18%。因此，利用響應(yīng)面分析法得到菌株I13最佳產(chǎn)酶條件真實(shí)可靠,具有實(shí)際意義。

3 結(jié) 論

堿性蛋白酶是在堿性范圍內(nèi)水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類，是應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中最為廣泛的酶類之一。本研究是對(duì)前期篩選出的一株產(chǎn)堿性蛋白酶高產(chǎn)菌種用響應(yīng)面法對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。利用Minitab15數(shù)據(jù)處理軟件優(yōu)化了產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的產(chǎn)酶條件，確定了接種量、酵母粉和培養(yǎng)溫度這3個(gè)對(duì)酶活力影響極顯著因素，用響應(yīng)面曲線及等值線擬合出一個(gè)二次回歸方程，找出產(chǎn)酶的最優(yōu)組合為：酵母粉質(zhì)量濃度10.2 g/L、培養(yǎng)溫度14.68 ℃和接種量5.32%。用此最佳產(chǎn)酶條件進(jìn)行了3次平行試驗(yàn)，其均值與理論預(yù)測值基本吻合。因此，經(jīng)過響應(yīng)面法的優(yōu)化，堿性蛋白酶活力可達(dá)到321.34 U/mL，比優(yōu)化前提高了151%。

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