毛 瑋 ， 侯 英 敏， 劉 志 文

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

油菜菌核病(Sclerotiniasclerotiorum)是由子囊菌亞門柔膜菌目核盤菌引起的一種真菌性病害，在油菜各個(gè)生育期和各部位均能為害，尤其以莖部受害最重。菌核病已成為一種世界性的病害，嚴(yán)重地影響了世界各國的油菜生產(chǎn)，在我國各油菜產(chǎn)區(qū)，特別是長江中下游產(chǎn)區(qū)，表現(xiàn)得尤為突出[1]。

關(guān)于油菜菌核病菌致病的生化機(jī)理，有研究表明核盤菌分泌的草酸毒素和纖維素酶等多種胞壁降解酶起著重要作用[2]，可以共同作用破壞植物細(xì)胞壁細(xì)胞。也有報(bào)道，草酸可誘導(dǎo)油菜體內(nèi)PPO、POD活性的變化，這些酶活性的變化與油菜的抗病機(jī)制有密切的關(guān)系[3]。此外，幾丁質(zhì)酶在植物抗性中的作用也引起了學(xué)者們的注意[4]。

本實(shí)驗(yàn)采用草酸與核盤菌分別處理離體的油菜葉片，系統(tǒng)分析油菜葉片中PPO、POD、纖維素酶與幾丁質(zhì)酶活力的變化，探討這些酶與油菜菌核病致病機(jī)理及抗病機(jī)制的關(guān)系，為進(jìn)一步防治菌核病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜研究室提供；甘藍(lán)型油菜華協(xié)一號由甘肅省種子推廣總站提供，種植于溫室的營養(yǎng)缽中。

1.2 方 法

1.2.1 采樣與接種

將核盤菌菌核移入PDA平板培養(yǎng)基上，在26 ℃下進(jìn)行活化培養(yǎng)，待瓊脂平板上長滿菌絲后用打孔器打成直徑為0.5 cm的菌絲瓊脂塊，供接種用。

選6葉期生長健壯的油菜葉片進(jìn)行離體處理，第1組為接入菌絲瓊脂塊，將離體葉片葉柄基部浸入盛有清水的平皿中，并用保濕棉保濕，用無菌鑷子夾菌絲瓊脂塊，放在葉片中部，將有菌絲的一面緊貼葉片正面；第2組為草酸溶液浸葉，將離體葉片葉柄基部浸入3 mmol/L草酸溶液中，保濕；第3組為清水對照組，將離體葉片浸入清水并保濕；各組處理設(shè)3次重復(fù)，分別測定各次重復(fù)的酶活力。

1.2.2 酶活力的測定

1.2.2.1 POD和PPO活性的測定

稱取鮮重0.1 g的葉片，于10 mL 0.1 mol/L pH 6.5的 PBS 冰浴中研磨，8 000 r/min離心10 min，上清即為粗酶液。

POD活性測定參照張笑宇[5]的方法：分別加入1 mL 0.1 mol/L pH 6.0 的PBS、2 mL 3% H2O2、1 mL 0.2 mol/L的愈創(chuàng)木酚溶液、1 mL粗酶液，于室溫反應(yīng)4 min后，在波長470 nm下測OD值。定義OD470每分鐘變化0.1所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PPO活性測定也參照張笑宇[5]的方法：分別加入4 mL 0.2 mol/L 鄰苯二酚溶液、1 mL 粗酶液，40 ℃水浴10 min后在波長400 nm下測OD值。定義OD400每分鐘變化0.1所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

1.2.2.2 纖維素酶活性的測定

稱取鮮重0.2 g的葉片，用2 mL 0.1 mol/L pH 4.6 的HAc-NaAc溶解制成粗酶液。纖維素酶活性測定采用DNS法[6]。加入0.1 mL 1% CMC底物、0.4 mL PBS、1 mL粗酶液，50 ℃下水浴30 min。加入2 mL DNS，煮沸5 min。在520 nm下測OD值。定義每小時(shí)生成1 mg還原糖為一個(gè)酶活力單位。

1.2.2.3 幾丁質(zhì)酶活性的測定

稱取鮮重0.2 g的葉片，用2 mL 0.1 mol/L pH 5.0 HAc-NaAc制成粗酶液。按Boller等[7]的方法測定幾丁質(zhì)酶活力。加入0.1 mL幾丁質(zhì)溶液、0.4 mL PBS、1 mL粗酶液，35 ℃下水浴1 h。加入2 mL DNS，煮沸5 min。在520 nm下測OD 值。定義每小時(shí)生成1 mg還原糖為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片的選擇

不同生育期的油菜其酶活力差異較大，選擇生育期為6葉期與20葉期油菜進(jìn)行PPO與POD活力測定。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，將菌絲塊分別接種于生育期為6葉期與20葉期油菜的同一部位葉片，結(jié)果表明核盤菌侵染6葉期葉片的速度較快且病斑面積較大。

由表1可以看出，20葉期油菜的PPO活力較6葉期高，此外6葉期與20葉期油菜都含有大量的POD，且20葉期的POD活力明顯高于6葉期，這是因?yàn)檫^氧化物酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度[8]。因此綜合以上結(jié)果考慮選用6葉期油菜的葉片為實(shí)驗(yàn)材料。

表1 不同生長期PPO、POD活力

2.2 草酸濃度的選擇

選擇同一時(shí)期播種的6 葉期油菜的葉片，將離體葉片葉柄分別浸入到盛有3、6、9 mmol/L草酸溶液的平皿中，并以清水為對照。72 h后分別測PPO與POD活力，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，PPO、POD活力隨著草酸濃度增加而增大，但在6和9 mmol/L浸葉過程中草酸對葉片的損傷很大，干枯現(xiàn)象嚴(yán)重，影響了酶活力的測定和分析，故選用草酸濃度為3 mmol/L。

圖1 不同草酸濃度浸染后PPO、POD的變化

Fig.1 The activity of PPO and POD induced by different oxalic concentration

2.3 PPO和POD活力的變化

如圖2、3所示，經(jīng)草酸和核盤菌處理后，PPO和POD活力均有明顯變化。從圖2可以看出，在核盤菌誘導(dǎo)48 h內(nèi)，PPO活力較對照略有升高，但效果不明顯；誘導(dǎo)48 h后PPO活力開始升高，且都高于對照組。PPO活力在核盤菌誘導(dǎo)72 h后達(dá)到峰值，為43.4 U/g，較對照提高了42.76%，72 h后逐漸開始下降；草酸誘導(dǎo)96 h后PPO活力最高，為36.7 U/g。從圖3可以看出，POD的活性隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長呈先升高后降低的趨勢，經(jīng)過核盤菌和草酸誘導(dǎo)12 h后達(dá)到最大，分別為37.5和35.1 U/g；在48 h后開始逐漸下降，96 h接近對照組。

圖2 草酸處理和接種核盤菌后葉片中PPO活力的變化

Fig.2 PPO activity in leaves soaked in oxalic acid solution and inoculated withS.sclerotiorum

圖3 草酸處理和接種核盤菌后葉片中POD活力的變化

Fig.3 POD activity in leaves soaked in oxalic acid solution and inoculated withS.sclerotiorum

2.4 纖維素酶活力的變化

如圖4所示，草酸和核盤菌誘導(dǎo)初期，纖維素酶活力變化不明顯，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，48 h后酶活力開始逐漸升高，且均高于對照組，可推斷核盤菌在48 h后開始分泌纖維素酶。在接種核盤菌96 h后酶活達(dá)到高峰，為3.11 U/g，草酸誘導(dǎo)72 h后酶活力達(dá)到最大，為1.03 U/g。

圖4 草酸處理和接種核盤菌后葉片中纖維素酶活力變化

Fig.4 Cellulase activity in leaves soaked in oxalic acid solution and inoculated withS.sclerotiorum

2.5 幾丁質(zhì)酶活力的變化

如圖5所示，幾丁質(zhì)酶在核盤菌和草酸誘導(dǎo)48 h內(nèi)活力變化不明顯；在核盤菌誘導(dǎo)48 h后，幾丁質(zhì)酶活力大幅升高，72 h左右達(dá)到最大，為1.44 U/g，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，活力逐漸開始下降。草酸誘導(dǎo)48 h后也使得幾丁質(zhì)酶活力升高，但沒有核盤菌作用明顯。

圖5 草酸處理和接種核盤菌后葉片中幾丁質(zhì)酶活力變化

Fig.5 The change of chitinase activity in leaves soaked in oxalic acid solution and inoculated withS.sclerotiorum

3 討 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，核盤菌和草酸都可以誘導(dǎo)油菜葉片中PPO和POD的活性提高，從而提高植物的抗病性。分析酶活力升高的原因，一方面是油菜發(fā)病后激活了相應(yīng)的與POD和PPO有關(guān)的信號分子，使POD和PPO次生代謝增強(qiáng)，其含量增加[9]；另一方面PPO和POD參與酚類物質(zhì)的氧化，植物受病原菌侵染時(shí)會生成大量具有抗菌素性質(zhì)的酚化合物，殺死寄主本身細(xì)胞的同時(shí)也能殺死侵染的病原物，因此PPO和POD活性的增加可以大大增加酚氧化物的含量，從而增強(qiáng)植物抗病的能力。

纖維素酶被認(rèn)為與病菌的致病力密切相關(guān)，在發(fā)病過程中可能起一種分解寄主組織細(xì)胞壁提供營養(yǎng)的作用[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在接種核盤菌96 h后纖維素酶活力達(dá)到最大，說明核盤菌入侵葉片組織時(shí)大量分泌纖維素酶，加快了核盤菌對細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞，使葉片迅速腐爛。同時(shí)核盤菌所分泌的草酸降低了組織的pH使酶活性達(dá)到高峰，充分說明了草酸和纖維素酶是油菜菌核病重要的治病因子。

有研究表明，幾丁質(zhì)酶可以水解真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)。在本研究中，核盤菌和草酸侵染72 h后幾丁質(zhì)酶活力大大提高，分解核盤菌細(xì)胞壁中的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，將幾丁質(zhì)水解成小分子的還原性寡糖，具有攻擊細(xì)胞壁的能力，推斷幾丁質(zhì)酶參與植物防衛(wèi)反應(yīng)。

[1] 韋善君,陳學(xué)章,李國慶,等. 盾殼霉在油菜花瓣上萌發(fā)的影響因子分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 18(6):254-257.

[2] CESSNA S G, SEARS V E, DICKNAN M B, et al. Oxalic acid, a pathogenicity factor forSclerotiniasclerotiorum, suppresses the oxidative burst of the host plant[J]. Plant Cell, 2000, 12(11):2191-2199.

[3] 劉勝毅,周必文,潘家榮. 油菜對毒素草酸的吸收代謝與抗性機(jī)理[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 1998, 28(1):33-37.

[4] 徐同,柳良好. 木霉幾丁質(zhì)酶及其對植物病原真菌的拮抗作用[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2002, 32(2):97-102.

[5] 張笑宇,劉正坪,胡俊,等. 向日葵菌核病菌毒素對向日葵體內(nèi)幾種酶活性的影響[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 20(1):49-52.

[6] 王琳,劉國生,王林嵩,等. DNS法測定纖維素酶活力最適條件研究[J]. 河南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 1998, 26(3):66-69.

[7] BOLLER T, GEHRI A, MOUCH F, et al. Chitinase in bean leaves:induction by ethylene, purification, properties, and possible function[J]. Planta, 1983, 157(1):22-31.

[8] 席玙芳,羅自生,程度. 竹筍采后木質(zhì)化與多酚氧化酶、過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性的關(guān)系(簡報(bào))[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2001, 37(4):294-295.

[9] 尹德明,丁得亮,鄭志廣,等. 水稻感染小球菌核病后多酚氧化酶活性的研究初報(bào)[J]. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 10(1):14-17.

[10] 雙桑,阮穎,彭冬平,等. 油菜菌核病及抗病育種研究進(jìn)展[J]. 作物研究, 2006(5):552-556.