韓 飛,楊致邦

(1.重慶三峽中心醫(yī)院微生物免疫科,萬州404000;2.重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室 400016)

幽門螺桿菌重組1188蛋白的表達＊

韓 飛1,楊致邦2

(1.重慶三峽中心醫(yī)院微生物免疫科,萬州404000;2.重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室 400016)

目的表達幽門螺桿菌(H.pylori)重組1188蛋白,為研究幽門螺桿菌的黏附機制奠定基礎。方法用聚合酶鏈反應(PCR)技術從H.pylori標準株NCTC 11637的基因組DNA中擴增hp1188基因片段,插入原核表達載體pQE-30,構建重組載體pQE30-hp1188,經(jīng)DNA測序分析確認后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達。Ni2+-N TA樹脂純化表達蛋白,十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析表達形式和表達量。結果重組表達質(zhì)粒pQE30-hp1188構建成功,所得序列完整,插入的基因片段全長810 bp,與基因文庫中的hp1188基因同源性達98%。SDS-PAGE顯示表達產(chǎn)物相對分子質(zhì)量約為30.6 kD,與預期一致,蛋白表達量占全菌總蛋白的47%,上清液和沉淀中均有表達,重組蛋白純化后純度達90%以上。結論成功克隆hp1188基因,并在大腸桿菌DH5α中獲得高效表達。

螺桿菌,幽門;hp1188基因;克隆;表達

幽門螺桿菌(helicobacter pylori,H.pylori)感染與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃腺癌和黏膜相關性淋巴樣組織淋巴瘤密切相關,被世界衛(wèi)生組織列為胃癌等腫瘤發(fā)生的相關致病菌[1-2]。目前,關于H.pylori的致病機制尚不明了,但H.pylori必須首先定植于人胃黏膜才能進一步發(fā)揮其致病作用,而黏附是H.pylori定植在胃黏膜表面的前提。決定H.pylori黏附的因素包括動力、尿素酶和黏附素。黏附素是H.pylori黏附的物質(zhì)基礎。目前國內(nèi)外文獻報道的H.pylori黏附素較多[3-6],其中已經(jīng)證實的有HpA、A lpA、A lpB、BabA和Hop Z,尚有SabA、OipA等仍待確認[7]。2005年Rubinsztein-Dunlop等[8]利用一種新方法即鎳珠模型篩選出一種新的蛋白1188,該蛋白存在于H.pylori細菌表面,表達量很高,并與黏附有關。Rubinsztein-Dunlop等[8]研究發(fā)現(xiàn)編碼該蛋白的hp1188基因為H.pylori所特有,且相當保守,與已知的黏附素序列無同源性。本實驗根據(jù)基因文庫中提供的hp1188序列,以標準菌株H.pylori NCTC 11637基因組為模板,利用基因工程技術克隆和表達重組hp1188蛋白,為進一步研究H.pylori感染的黏附機制、防治H.pylori感染奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 H.pylori標準菌株NCTC 11637由重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室保存,大腸桿菌DH5α菌株和pQE-30質(zhì)粒均為重慶三峽中心醫(yī)院微生物免疫科保存。

1.2 試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京百泰克生物公司,質(zhì)粒提取試劑盒購自OM EGA公司,膠回收試劑盒為上海華舜公司產(chǎn)品,聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、蛋白質(zhì)Marker為Fermentas公司產(chǎn)品,DL-2000 DNA Marker、T4連接酶試劑盒、限制性內(nèi)切酶(Bam H I、Xhol I)購自Takara公司,Ni2+-NTA層析柱為Invitrogen產(chǎn)品,瓊脂糖、IPTG、SDS、DTT、EDTA、丙烯酰胺、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍R250均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 H.pylori菌株的獲取 將H.pylori標準菌株NCTC 11637接種于7%羊血瓊脂平板上,用產(chǎn)氣袋法形成微需氧環(huán)境,37℃培養(yǎng)3～4 d后,挑取可疑菌落按常規(guī)方法鑒定,確認后傳代培養(yǎng)。

1.4 H.pylori基因組DNA的提取 從固體培養(yǎng)基上刮取生長良好的菌落,按細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取H.pylori基因組DNA。

1.5 引物設計及合成 根據(jù)GeneBank公布的hp1188基因序列(Gene ID:899950),利用Premier Premier5.0軟件設計引物,引物序列為P1:5′-CGC-CTCGAG-A TGAAGAGAGTTAGAGAA-3′(引入XhoⅠ酶切位點),P2:5′-CCC-GGA TCC-TCA GCA AA T A TT TTT T-3′(引入Bam HⅠ酶切位點)。引物由Invitrogen公司合成。

1.6 hp1188基因的PCR擴增 以提取的DNA為模板進行PCR擴增。擴增條件:95℃預變性5 min;94℃30 s,47℃30 s,72℃58 s,共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR擴增片段經(jīng)終濃度10 g/L瓊脂糖凝膠電泳純化切膠回收。

1.7 重組質(zhì)粒pQE30-hp1188的構建 參照文獻[9]方法,將質(zhì)粒pQE-30和純化回收的hp1188基因片段分別用Bam HⅠ和XhoⅠ進行雙酶切,回收酶切片段,在T4連接酶試劑盒作用下16℃連接6 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,氨芐抗性篩選陽性重組子,抽提質(zhì)粒,經(jīng)PCR和雙酶切鑒定,篩選出陽性克隆,并送上海英駿生物科技有限公司測序。

1.8 重組蛋白的誘導表達 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌的單菌落接種于LB(含氨芐西林100 mg/L)液體培養(yǎng)基中,于37℃培養(yǎng)過夜,以1∶20的比例接種上述過夜菌于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至菌濃度為A600=0.4～0.6。加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L,37℃誘導表達,分別收集誘導表達1、3、4、5、24 h菌體進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,確定最佳誘導表達條件。在最佳條件誘導下,收集菌液1 m L進行全菌蛋白的SDS-PAGE,考馬斯亮藍染色,通過誘導前、后全菌蛋白染色條帶的對照,檢測相應分子質(zhì)量的外源性蛋白表達條帶。將誘導表達的菌液在4℃,5 000×g離心10 min收集菌體,按每克濕菌3 mL比例加入超聲破碎緩沖液(每100 mL含2 mol/L Tris-HCL 1 m L、β-巰基乙醇0.03 g)重懸菌體,冰浴下超聲破碎細菌,條件為功率280 W,破碎3 s,間隔3 s,總破碎時間為40 min。然后4℃,10 000×g離心20 min,分別收集裂解后所得到的沉淀與上清液,經(jīng)12%SDS-PAGE分析重組蛋白的表達形式。

1.9 重組蛋白的純化 收集2 L誘導表達的菌液,在冰浴下超聲裂解后的上清液中加2 mL 50%Ni2+-NTA樹脂溶液, 0℃冰浴1 h,其間不斷振蕩。將混合物轉(zhuǎn)入下墊濾紙的注射器中,自然流干。用洗滌液(50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑)洗柱。分別收集洗滌液W 1～4。用洗脫液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl, 250 mmol/L咪唑)洗柱,分別收集洗滌液E1～11。取適量樣品進行SDS-PAGE分析,收集目的蛋白管,PEG 8000濃縮,最后將純化樣品分裝,低溫保存。采用Bradford法對純化的重組蛋白進行定量。

2 結 果

2.1 hp1188基因的PCR擴增 PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖電泳分析可見約810 bp的單一條帶,片段大小與預期一致,見圖1。

2.2 重組質(zhì)粒pQE30-hp1188的鑒定 重組質(zhì)粒pQE30-hp1188轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后,經(jīng)PCR及雙酶切鑒定,均可見約810 bp的目的條帶,見圖2。陽性克隆DNA測序結果顯示,插入的基因片段全長810 bp,與GenBank公布的H.pylori菌株26695相應序列進行核苷酸序列比對分析,基因序列的同源性為98%。

圖1 hp1188基因片段的PCR擴增結果

圖2 重組質(zhì)粒pQE30-hp1188的PCR及酶切鑒定

圖3 重組蛋白最佳IPTG誘導濃度的測定

2.3 重組蛋白的最佳表達條件 收集誘導前、后的細菌全菌蛋白進行SDS-PAGE分析,誘導后的細菌較誘導前在相對分子質(zhì)量約30.6 kD處可見明顯增加的外源蛋白表達條帶。最佳誘導表達條件為37℃,IPTG濃度1.0 mmol/L,誘導時間4 h,可得到最大的表達量,見圖3、4。

2.4 重組蛋白的表達形式 SDS-PAGE分析表明,超聲破碎菌的上清液與沉淀中均可見目的蛋白表達條帶,見圖5。用圖像軟件分析表明可溶性蛋白占全菌蛋白的47%。

2.5 重組蛋白純化產(chǎn)物的鑒定 SDS-PAGE分析表明,純化產(chǎn)物主要存在于第2～7管洗脫液中,純度可達90%,見圖6。用Bradfo rd法測定純化重組蛋白的含量為1.0 mg/m L。

圖4 重組蛋白最佳誘導時間的測定

圖5 重組蛋白表達形式的鑒定

圖6 純化重組蛋白的SDS-PAGE分析

3 討 論

H.pylori在胃內(nèi)集中定植于胃竇部,生長于胃黏膜上皮表面與黏液層之間,是組織細胞外的寄生菌。H.pylori的高感染率及其對人類健康的危害越來越引起廣泛關注,目前H.pylori治療主要應用抗生素和質(zhì)子泵抑制劑,但H.pylori感染存在治療后易復發(fā)和再感染、易產(chǎn)生耐藥性、患者對藥物依從性差,以及藥物不良反應和價格昂貴等問題。因此,學者們認識到有必要研制H.pylori疫苗[10-11],疫苗的成功研制及應用在H.pylori感染的防治策略中意義重大。

合理選擇抗原是疫苗成敗的關鍵。對H.pylori的研究表明,H.pylori在胃內(nèi)定植的關鍵環(huán)節(jié)是黏附,宿主細胞的特異性黏附由黏附素受體系統(tǒng)介導,依賴于黏附分子上某些特定的氨基酸位點與受體的結合。隨著對黏附素[12-14]本質(zhì)的認識不斷加深和黏附素在H.pylori定植過程中的決定性作用,黏附素作為保護性抗原可能成為一個新的疫苗研究嘗試,可以從黏附素出發(fā)尋找保護性抗原,從而在感染的初期就能通過阻斷黏附將H.pylori清除出人體。黏附素能夠成為H.pylori疫苗候選抗原是由于其具備以下幾個優(yōu)點:位于細菌表面從而為免疫反應提供靶位;具有較高的保守性,而保守性抗原通常是疫苗成分的要求之一;蛋白質(zhì)成分能夠通過基因工程大規(guī)模生產(chǎn)和純化。

Rubinsztein-Dunlop等[8]從H.pylori的全基因組中挑選出5個可能編碼膜蛋白的開放閱讀框(ORF),分別在E.coli BL21中表達出帶組氨酸標簽的這5種蛋白,研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)hp1188基因編碼的蛋白hp1188具有黏膜結合特性,其包被的鎳珠能夠與人AGS細胞結合,且hp1188蛋白在H.pylori菌體表面表達量很高。hp1188基因全長810 bp,其核苷酸或氨基酸序列高度保守,為H.pylori所特有,編碼蛋白的相對分子質(zhì)量為30.6 kD。因此,研究hp1188的功能以及作為抗H.pylori感染的保護性抗原都具有重要意義。本研究選擇H.pylori的hp1188基因,將全長hp1188基因克隆入原核表達質(zhì)粒pQE30,成功構建了pQE30-hp1188重組載體,并在DH5α中獲得高效表達,為下一步表達產(chǎn)物的特性分析,進一步研究H.pylori黏附的分子機制和免疫保護作用、制備防治H.pylori定植的疫苗奠定了實驗基礎。

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Expression of recombinant Helicobacter pylori1188 protein＊

Han Fei1,Yang Zhibang2
(1.Department of Microbiology and Immunology,Chongqing Three Gorges Central Hospital,Chongqing 404000,China;2.Department of Pathobiology of Basic Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

ObjectiveTo express the recombinant Helicobacter pylori 1188 protein in order to lay a foundation for the study on its adhesion.MethodsThe hp1188 gene was amplified from chromosomal DNA of strain NCTC 11637 by PCR.The PCR product was inserted into the expression vector pQE-30.And the recombinant vector pQE30-hp1188 was identified by DNA sequencing and transformed to E.coli DH5αfor expression under IPTG induction.The recombinant protein was purified by Ni2+-NTA agarose and identified by SDS-PAGE.ResultsThe recombinant expression vectors pQE30-hp1188 was successfully constructed.It was found that the total length of gene cloned was 810 bp with 98%sequence homology with hp1188 genes in GenBank.The molecular weight of its expression products was found to be about 30.6 kD as determined by SDS-PAGE,the percentage of expression was about 47%of total cell proteins,and the supernatant and pellet had both expressed.Its purity was over 90%after purified with Ni2+-NTA agarose.Conclusionhp1188 gene is successfully cloned and highly expressed in E.coli DH5α.

helicobacter pylori;hp1188 gene;clone;exp ression

2010-03-18

2010-05-09)

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.03.004

A

1671-8348(2011)03-0218-03

重慶市教委項目(渝教科2003-7-3);重慶市科委攻關項目(CSTC,2005EA 5020)。