趙麗娟, 郭 敏

(懷化學院11生命科學系; 2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室; 31湘西藥用植物與民族植物學湖南省高校重點實驗室,湖南懷化 418008)

黃斑姜中期染色體CPD染色和45S rDNA熒光原位雜交分析

趙麗娟1,2,3, 郭 敏1

(懷化學院11生命科學系; 2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室; 31湘西藥用植物與民族植物學湖南省高校重點實驗室,湖南懷化 418008)

為了對黃斑姜(Zingiber flavo-maculatumS1Q1T ong1)的染色體進行識別并對該物種基因組的結(jié)構(gòu)進行初步研究,利用PI和DAPI組合(CPD)染色和45S rDNA探針熒光原位雜交對中期染色體進行了分析.結(jié)果顯示,黃斑姜具有2對45S rDNA位點,分別位于第3、4號染色體的短臂,對應于相應染色體上的顯著的CPD帶區(qū)1基于rDNA位點和染色體測量數(shù)據(jù),建立了黃斑姜的準確而詳細的分子細胞遺傳學核型.黃斑姜核型公式為2n=2X=22= 12m+6sm+4st(SAT),其核型不對稱性為2B型.

黃斑姜; 核型; CPD染色; 45S rDNA; 熒光原位雜交

黃斑姜(Zingiber flavo-maculatumS1Q1T ong)為姜科(Zingiberaceae)姜屬(ZingiberBoehm1)植物.我國現(xiàn)有的黃斑姜大都產(chǎn)云南南部的勐臘、景洪[1];生于海拔580—1 500米的常綠闊葉林下,花期7—8月,果期9—12月.迄今為止,對黃斑姜的研究大多是形態(tài)學、栽培技術(shù)、營養(yǎng)價值和保健作用等方面[2-3],核型分析、DNA物理定位和基因組結(jié)構(gòu)分析的報道很少,因此對其進行分子細胞遺傳學研究十分必要.

本研究取新生根尖分生區(qū)作為材料,采用去壁低滲火焰干燥制片法[4]制備形態(tài)良好的有絲分裂中期染色體,并采用改良的CPD染色技術(shù)和45S rDNA熒光原位雜交技術(shù)對黃斑姜的染色體進行分析,為識別黃斑姜的染色體提供新的標記,并結(jié)合染色體常規(guī)測量,建立其分子細胞遺傳學核型.

1 實驗材料與方法

供試材料黃斑姜(Zingiber flavo-maculatumS1Q1T ong),由中科院昆明植物研究所黃老師提供1

45S rDNA探針來自番茄基因組,由美國Nebraska大學Arumuganathan教授提供145S rDNA片段長度為911 kb,包括518S,18S和25S亞單位和非轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)(IGS),克隆載體為pUC18,酶切位點為K pn I.

有絲分裂染色體用根尖按Song等[4]的方法制備1將黃斑姜置于沙土中于溫室中培養(yǎng),待根長到1～115 cm時剪取根尖,用α—溴代萘室溫下處理1 h1用甲醇:冰醋酸(3:1)于4℃固定過夜1固定的根尖水洗后用1%的纖維素酶(CellulaseRS)、1%的果膠酶(Pectolyase Y23)及1%的蝸牛酶(Cytohelicase)的混合液(用檸檬酸緩沖液配制,pH 4.5)于28℃酶解6 h.火焰干燥法制片.染色體制片置-20℃貯存?zhèn)溆?

CPD染色參照佘朝文等的方法進行[5].觀察在Olympus BX60熒光顯微鏡下進行,用紫外光濾色片(UV)觀察DAPI染色,用綠色激發(fā)濾色片(WG)觀察PI染色.利用冷凝CCD照相系統(tǒng)(Cool SNAP EZ, Photomatrics)和MetMorph軟件拍攝和合成照片1

熒光原位雜交在已進行CPD的染色體裝片上進行.原位雜交和信號檢測按佘朝文的方法[5]進行.染色體用DAPI復染,用Olympus BX60熒光顯微鏡觀察染色體和雜交信號,用冷凝CCD照相系統(tǒng)(Cool SNAP EZ, Photomatrics)和MetMorph軟件拍攝和合成照片1

圖片處理和染色體測量使用Adobe Photoshop軟件進行,核型分析參照李懋學和陳瑞陽[6]的方法進行1

2 結(jié)果

黃斑姜染色體經(jīng)CPD染色后,有兩對染色體出現(xiàn)了顯著的紅色CPD帶紋(圖1A,白色箭頭所示),說明該染色體區(qū)段為GC豐富區(qū)[5],通過觀察多個分裂相發(fā)現(xiàn),這兩對染色體具有隨體,CPD帶位于短臂的次縊痕近端一側(cè).相繼的45S rDNA FISH顯示,黃斑姜具有2對45S rDNA位點(圖1B,白色箭頭所指綠色信號),對應于相應染色體上的顯著的CPD帶區(qū),而且CPD帶和FISH信號的大小和強度上也是對應的.

圖1 黃斑姜染色體的CPD顯帶(A)、45S rDNA熒光原位雜交(B)、核型(C)和核型模式圖(D)

表1 黃斑姜的核型分析參數(shù)表

基于CPD帶和45SrDNA FISH信號,結(jié)合常規(guī)的染色體測量(表1),對黃斑姜的染色體進行區(qū)分、配對,建立了體現(xiàn)它們?nèi)旧w基本形態(tài)特征、CPD帶及45S rDNA位點分布情況的分子細胞遺傳學核型(圖1C).核型分析結(jié)果表明,顯著的CPD帶和對應的45S rDNA雜交信號分別位于第3、4對染色體的短臂.黃斑姜的核型公式為2n=2x=22=12m+6sm+4st(SAT).根據(jù)染色體長度進行分類的方法[6,7],最長和最短染色體的比值是2.25,臂比大于2的染色體的比例為0.27,因此核型不對稱性屬2B型.核型模式圖見圖1D1

3 討 論

本研究中采用了CPD染色對黃斑姜的染色體進行分析.CPD染色能夠精確的顯示植物基因組的GC豐富的45S rDNA位點[5].我們的結(jié)果表明,所有的45S rDNA雜交信號都出現(xiàn)在相應染色體位置的CPD帶區(qū),說明CPD染色能有效地對45S rDNA進行物理定位.黃斑姜與在大麥、四棱豆、番茄等物種上檢測到非rDNA CPD帶不同[8],其CPD帶只專一地顯現(xiàn)在核仁組織區(qū)(NOR).

已有的研究報道了姜屬的其他種植物的染色體數(shù)目[9,10],但并沒有進行核型分析.已報道的姜屬植物的染色體都為2n=22[9,10]1Mahautyh(1970)認為姜科植物姜屬的染色體基數(shù)為11,而且?guī)缀跞嵌扼w[11]1我們的結(jié)果顯示黃斑姜也是二倍體,其染色體為2n=22,其染色體基數(shù)也為11.

我們的實驗對黃斑姜染色體的45S rDNA位點進行了FISH定位,明確其具有2對45S rDNA位點145S rDNA FISH不僅能夠準確識別植物的rDNA位點,而且其雜交信號還可以作為標記用于核型分析中染色體的精確識別,而且通過同一屬不同物種的45S rDNA比較定位分析,還以探討物種間的進化關(guān)系[12].因此我們的研究對進一步從分子細胞遺傳學水平研究姜屬的基因組及物種間的進化關(guān)系具有重要意義.

姜屬植物的細胞遺傳研究材料常取自室外培養(yǎng)的植物,較難獲得理想的染色體裝片,這也是姜屬植物染色體研究進展緩慢的原因之一1本實驗的染色體制備方法對其他姜屬植物的細胞遺傳學研究也具有重要的參考價值1

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Abstract:In order to identify the chromosomes ofZingiber flavo-maculatumS.Q.T ong.and reveal preliminarily the genome organization,CPD(combined PI and DAPI)staining and FISH with 45S rDNA probe were applied to analyze the mitotic metaphase chromosomes.Two pairs of 45S rDNA sites were detected on the short arms of the chromosome 3 and 4,respectively, corresponding to the prominent red CPD bands.The molecular cytogenetic karyotypesofZingiberflavo-maculatumwas constructed based on the data of rDNA and chromosome measurements.The karyotype formula is 2n=2X=22=12m+6sm+4st(SAT)and the karyotype asymmetry belongs to 2B type.

Key words:Zingiber flavo-maculatum; karyotype; CPD staining; 45S rDNA; fluorescence in situ hybridization(FISH)

Analysis of Mitotic Metaphase Chromosomes ofZingiber flavo-maculatum using CPD Staining and FISH with 45S rDNA Probe

ZHAO Li-juan1,2,3, G UO Min1
(1.Department of Life Sciences; 2.Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province;
31Key Laboratory of Xiangxi Medicinal Plants and Ethnobotany of Hunan Higher Education,Huaihua University,Huaihua,Hunan 418008)

Q343

A

1671-9743(2011)02-0045-03

2011-02-10

湖南省教育廳一般項目(07C503).

趙麗娟(1979-),女,湖南溆浦人,懷化學院講師,碩士,主要研究遺傳學.