李 敏,楊建華,李 淵,胡君萍,*
(1.新疆醫(yī)科大學藥學院,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830011)
酒花黃酮提取工藝和含量測定
李 敏1,楊建華2,李 淵1,胡君萍1,*
(1.新疆醫(yī)科大學藥學院,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830011)
建立酒花黃酮的提取方法和含量測定方法。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法,以蘆丁為對照品,通過單因素試驗和L9(34)正交設(shè)計確定酒花黃酮的提取方法,并測定和比較酒花、酒糟和啤酒中黃酮的含量。結(jié)果表明:酒花黃酮提取方法為樣品加入50倍的甲醇,超聲提取2次,每次1h,酒花黃酮含量為69.98mg/g,酒糟和啤酒中黃酮的含量較低。對照品蘆丁在10.2~40.8μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系,平均回收率99.33%,RSD=3.60%。該提取方法合理,含量測定方法簡便、快速、準確,可用于酒花黃酮提取物制備及其質(zhì)量控制。
酒花;黃酮;提取工藝;含量測定
啤酒花Humulus lupulusL.是???Moraceae)葎草屬(HumulusLinn.)多年生草質(zhì)蔓生藤本植物,其雌性球穗花序簡稱酒花[1]。酒花是一種使用歷史悠久的藥食同源植物,不僅用于啤酒的釀制,還具有抗菌和鎮(zhèn)靜作用,傳統(tǒng)醫(yī)學用作結(jié)核病、麻風病、神經(jīng)衰弱癥的治療[2-3]。酒花原產(chǎn)歐洲,主產(chǎn)地分布于美國、歐洲、澳大利亞、南美洲和中國,我國新疆天山、阿爾泰山的山坡林間有大量野生分布,在東北、華北有栽培[4]。酒花富含樹脂、揮發(fā)油、多酚、黃酮等多種生物活性成分,其中黃酮類成分(酒花黃酮)是代表酒花多種生物活性的一類重要物質(zhì)。酒花黃酮包括黃
酮醇糖苷和異戊二烯查爾酮兩類,前者主要包括黃芪苷、異槲皮素、蕓香苷、山柰酚苷等成分,具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗氧化等活性[5];后者包括黃腐酚、異黃腐酚、異戊二烯基柚皮素等成分,為酒花所特有,具有預(yù)防癌癥和抑制癌細胞擴增[6-9]、抗病毒[10]、抗菌[11]、抗氧化[12]及雌激素樣作用[13]。酒花黃酮結(jié)構(gòu)類型多樣、生物活性顯著、在啤酒花中含量高、藥食用途廣泛,顯示了良好的開發(fā)利用前景。新疆是酒花的主產(chǎn)區(qū),酒花資源豐富,但其藥用價值尚未得到有效開發(fā)。本實驗建立酒花黃酮的提取工藝和含量測定方法,比較不同酒花樣品的黃酮含量,為進一步制備酒花黃酮提取物及其功能性開發(fā)利用提供一定參考。
1.1 材料、試劑與儀器
顆粒酒花(產(chǎn)地新疆吉木薩爾縣)經(jīng)新疆醫(yī)科大學藥學院胡君萍副教授鑒定為啤酒花Humulus lupulusL.;啤酒花及酒糟樣品干燥,粉碎,過40目篩,冷藏備用。顆粒酒花、酒糟、啤酒 新疆烏蘇啤酒廠。
蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、9 5%乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮(均為分析純)。
ST-02A型多功能粉碎機 永康帥通工具有限公司;AB104-N電子天平 上海Mettler Toledo公司;SX721分光光度計 山東高密分析儀器廠;KQ300DE型數(shù)控超聲清洗機(功率300W,頻率400kHz) 昆山市超聲儀器有限公司;KD-S2.4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠。
1.2 方法
1.2.1 酒花黃酮測定原理[14]
在黃酮類化合物溶液中加入鋁離子試劑后,黃酮類化合物中的酚羥基與鋁離子生成絡(luò)合物,控制適宜的pH值,所生成的絡(luò)合物在可見區(qū)能獲得特征吸收峰,其質(zhì)量濃度與吸光度符合比爾定律,其顏色深淺與黃酮類化合物的量成一定的比例關(guān)系,可以定量測定。
1.2.2 對照品溶液的配制
精密稱取干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁對照品25.5mg,置于50mL容量瓶中,用50%甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度0.51mg/mL的對照品溶液。
1.2.3 供試品溶液的制備
精密稱取顆粒酒花粉末1g、酒糟粉末3g,加入50倍體積的甲醇溶液,超聲提取2次,每次1h,過濾,合并濾液,濃縮,定容至50mL,搖勻,即分別制得酒花供試品溶液和酒糟供試品溶液。
啤酒臨用前超聲20min去除泡沫,即得啤酒供試品溶液(每100mL啤酒的質(zhì)量為4.1382g)。
1.2.4 測定波長的選擇
精密吸取酒花供試品溶液1mL,置于10mL容量瓶中,加入5% NaNO2溶液0.3mL,搖勻,放置6min后加入10% Al(NO3)3溶液0.3mL,放置6min,再加入10%NaOH溶液4.0mL,搖勻,用溶劑稀釋至刻度,搖勻。以溶劑代替供試品溶液同法制備空白對照,15min后掃描200~800nm波長范圍的吸光度,確定最大吸光度在510nm,因此分光光度法選擇510nm為測定波長。
1.2.5 標準曲線的制備
精密量取蘆丁對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL于10mL容量瓶中,分別加入5%NaNO2溶液0.3mL,搖勻,放置6min后加入10% Al(NO3)3溶液0.3mL,放置6min,再加入10% NaOH溶液4.0mL,搖勻,用溶劑稀釋至刻度,15min于波長510nm處測定吸光度。以質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標、吸光度A為縱坐標,建立標準曲線,得回歸方程:A=0.0108C-0.023,r=0.9985,表明蘆丁在10.2~40.8μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。
1.2.6 精密度實驗
精密吸取酒花供試品溶液0.3mL,按1.2.5節(jié)方法測定吸光度6次,其RSD為2.46%。
1.2.7 穩(wěn)定性實驗
精密吸取酒花供試品溶液0.3mL,按1.2.5節(jié)方法,每隔0.5h測定1次吸光度,共測5次,計算吸光度的RSD為1.33%,表明顯色液在2.5h內(nèi)較穩(wěn)定。
1.2.8 重復(fù)性實驗
精密吸取0.3mL酒花供試品溶液6份,按1.2.5節(jié)方法測定吸光度,計算結(jié)果的RSD為2.00%。
1.2.9 回收率實驗
精密吸取酒花供試品溶液9份各0.15mL,分別加入對照品溶液(0.51mg/mL)0.2、0.4、0.6mL,按1.2.5節(jié)方法測定吸光度,計算回收率和RSD。結(jié)果見表1。
表1 回收率實驗結(jié)果Table 1 Results of recovery rate experiments
1.2.10 酒花黃酮提取工藝優(yōu)化
在建立酒花黃酮含量測定方法的基礎(chǔ)上,采用單因素試驗篩選了酒花黃酮的5種提取溶劑(水、乙醇、甲醇、丙酮和乙酸乙酯)和4種提取方法(冷浸法、回流法、索式提取法和超聲法);并采用L9(34)正交設(shè)計,考察了溶劑體積、提取時間和提取次數(shù)對酒花黃酮含量的影響,優(yōu)化并確定了酒花黃酮的最佳提取工藝。
1.2.11 樣品中黃酮含量測定
按1.2.3節(jié)分別制備酒花、酒糟和啤酒供試品溶液各6份,精密吸取酒花供試品溶液0.3mL、酒糟供試品溶液4.0mL、啤酒供試品溶液4.0mL,按1.2.5節(jié)方法測定吸光度,代入回歸方程計算各供試品中黃酮的含量[黃酮含量/(mg/g)=CDV/m×100,其中C為樣品溶液質(zhì)量濃度/(μg/mL),V為樣品溶液稀釋后總體積/mL,D為樣品稀釋倍數(shù),m為樣品質(zhì)量/g]。
2.1 酒花黃酮提取工藝的篩選
2.1.1 提取溶劑的選擇
精密稱取顆粒酒花粉末1g共10份,分別加入水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯各5 0 m L,超聲提取30min,過濾。精密吸取濾液1.0mL,按1.2.5節(jié)方法測定吸光度,另取25mL濾液濃縮干燥,計算浸膏得率[浸膏得率/%= 浸膏質(zhì)量×2/樣品質(zhì)量×100]。結(jié)果見表2。
表2 不同溶劑提取液的吸光度和提取率(n=2)Table 2 Absorbance and extraction rates of the extracts using different extraction solvents (n=2)
由表2可知,各溶劑對酒花黃酮提取率差異明顯,以甲醇溶液的吸光度和浸膏得率為高,因此選擇甲醇為酒花黃酮的提取溶劑。
2.1.2 提取方法的選擇
精密稱取顆粒酒花樣品粉末適量,加入50倍量甲醇溶液,分別采用冷浸法(室溫浸泡30min)、回流法(75℃水浴回流30min)、索式提取法(75℃水浴至提取液無色)和超聲法(超聲30min)提取,提取液冷卻至室溫,補足質(zhì)量損失,過濾。分別取濾液1.0mL,按1.2.5節(jié)方法測定吸光度,另取25mL濾液濃縮干燥,計算浸膏得率。結(jié)果見表3。
表3 不同提取方法所得提取液的吸光度和提取率(n=2)Table 3 Absorbance and extraction rates of the extracts using different extraction methods (n=2)
結(jié)果表明,上述提取溶液中以超聲法吸光度略高,而回流法浸膏得率略高,考慮到超聲法簡便易行,故采用超聲法提取酒花黃酮。
2.1.3 酒花黃酮提取工藝優(yōu)化
在以上單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用L9(3)4正交設(shè)計(表4),確定酒花黃酮最佳提取工藝。精密稱取酒花樣品粉末各1g,以甲醇為提取溶劑,采用超聲提取法,優(yōu)選溶劑體積、提取時間和提取次數(shù),提取液過濾,濾液濃縮并定容至50mL。精密吸取上述溶液0.3mL,按1.2.5節(jié)方法測定吸光度,按回歸方程計算黃酮的含量。結(jié)果見表5。
表4 酒花黃酮提取正交試驗的因素和水平Table 4 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing the extraction conditions of flavonoids
表5 酒花黃酮提取正交試驗結(jié)果(n=2)Table 5 Results and analysis of orthogonal tests for optimizing the extraction conditions of flavonoids (n=2)
由表5極差分析可得,各因素對黃酮提取工藝的影響順序為B(提取時間)>C(提取次數(shù))>A(溶劑體積),酒花黃酮最佳提取工藝A2B2C2,即精密稱取供試品粉末適量,加入50倍體積甲醇溶液、超聲提取2次、每次1h。
2.2 樣品中黃酮含量測定
分別制備酒花、酒糟和啤酒供試品溶液,按1.2.10節(jié)方法測定各供試品中的黃酮含量。實驗結(jié)果見表6。結(jié)果表明,上述3種樣品中,顆粒酒花黃酮含量最高,其次為商品啤酒,而酒糟中黃酮含量很低。
表6 3種供試品中的黃酮含量(n=6)Table 6 Contents of total flavonoids in three samples (n=6)
本研究采用單因素和正交試驗確定了酒花黃酮的提取工藝,即精密稱取供試品粉末適量,加入50倍體積甲醇溶液、超聲提取2次、每次1h。并以蘆丁為對照品,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法測定顆粒酒花、酒糟和啤酒中黃酮的含量,方法操作簡便、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好,對設(shè)備要求低,是檢測酒花黃酮的可靠方法。
啤酒釀造企業(yè)使用的酒花制品有全酒花、酒花粉、顆粒酒花、酒花浸膏、酒花油制品等[15]。本實驗的研究對象顆粒酒花是世界上使用最廣泛的酒花制品,它是將粉碎至一定規(guī)格的粉狀酒花壓制成直徑為2~8mm,長約15mm的短棒,充以惰性氣體并包裝,因此顆粒酒花能有效防止酒花中有效成分的氧化和損失。酒花黃酮是酒花多酚的重要組成部分[16],本研究結(jié)果表明,顆粒酒花、酒糟和啤酒3種酒花樣品的黃酮含量差異很大,其中顆粒酒花黃酮含量最高,達69.98mg/g,而酒糟中黃酮含量極低,不足顆粒酒花的1%。
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Optimization of Extraction Process and Content Determination of Total Flavonoids inHumulus lupulusL.
LI Min1,YANG Jian-hua2,LI Yuan1,.H.UJun-ping1,*
(1. College of Pharmacy, Xinjiang Medical University,..830011, China;2. Affiliated Tumor Hospital, Xinjiang Medical University, 830011, China)
Ultrasonic extraction conditions for total flavonoids fromHumulus lupulusL. were optimized by single factor experiments and orthogonal design with the aim of establishing a sample preparation method for determination of the content of total flavonoids inHumulus lupulusL. by NaNO2-Al(NO3)3-NaOH colorimetric method using rutin as the reference. The optimal extraction process parameters were material-to-liquid ratio of 1:50, extraction duration of 1 h and repeated extraction number of 2. The content of total flavonoids fromHumulus lupulusL. was 69.98 mg/g under the optimal extraction conditions, which was much higher than that of residues and beer. The linear range was between 10.2 μg/mL and 40.8 μg/mL with a correlation coefficient of 0.9985. The average recovery rate was 99.33% with a relative standard deviation of 3.60%. The extraction and determination methods were simple and feasible, which is suitable for the preparation and quality control of flavonoids extracted fromHumulus lupulusL.
Humulus lupulusL.;total flavonoids;extraction;determination
O623.54
A
1002-6630(2011)06-0016-04
2010-04-18
新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計劃重點項目(XJEDU2009I24)
李敏(1983—),女,講師,碩士,主要從事天然藥用植物資源的開發(fā)與利用研究。E-mail:hjp-yft@163.com
*通信作者:胡君萍(1971—),女,副教授,博士,主要從事新疆特色藥用資源的開發(fā)與利用研究。E-mail:yjh-yft@163.com