郭彥偉，聶 聰*，關(guān)雪芹，張 潔，楊貴恒

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250030）

啤酒花（Humulus lupulus L.）為蕁麻目大麻科葎草屬植物多年生草質(zhì)蔓生藤本植物的雌性球穗花序[1-2]。啤酒花主要用于啤酒釀造，其能夠保證啤酒的品質(zhì)并賦予啤酒獨(dú)特的風(fēng)味，被譽(yù)為“啤酒的靈魂”[2-3]。啤酒花主產(chǎn)于歐洲、美國、中國、澳大利亞等地。我國種植地主要集中在新疆、甘肅等地[4]。近年來，精釀啤酒迅猛發(fā)展，對啤酒花數(shù)量和質(zhì)量都有了很高的要求。酒花主要成分包括酒花樹脂、酒花油和多酚物質(zhì)，為啤酒提供香味、苦味[5-6]。啤酒的苦味主要由α-酸的異構(gòu)化、異α-酸、β-酸的氧化物、酒花多酚等物質(zhì)形成[5，7-8]。酒花油的成分非常復(fù)雜，目前已經(jīng)成功鑒定出了485種物質(zhì)，并推測酒花油中約存在1 000種物質(zhì)[7]。酒花多酚物質(zhì)是天然的抗氧化劑，參與抗氧化過程[9-10]。不同的酒花添加方式對啤酒風(fēng)味的影響有著很大差別，在麥汁煮沸開始時(shí)添加酒花，能使啤酒體現(xiàn)苦味。在儲酒期添加酒花，可以使啤酒具有清新的鮮酒花風(fēng)味[7]。

氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）因其具有檢測特定離子碎片的功能，使得對未知化合物的定性更加準(zhǔn)確，也因此被廣泛應(yīng)用于啤酒中酒花香氣物質(zhì)的定性和定量研究[11]。1978年有學(xué)者使用GC-MS鑒定出德國啤酒中超過110種酒花香氣物質(zhì)[12-13]。然而，由于啤酒基體的復(fù)雜性以及酒花香氣物質(zhì)在啤酒中僅微量存在，對啤酒樣品前處理顯得十分重要，目前最方便和流行的前處理方式是頂空固相微萃?。╤ead space-solid phase microextraction，HS-SPME）技術(shù)[14]，其具有簡便快速、靈敏度高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[9，15]。其所需樣品量小，同時(shí)無需萃取溶劑，大大節(jié)省了溶劑消耗，而且氣體樣品能夠直接進(jìn)行萃取分離，大大提高了氣體樣品的萃取效率。

采用頂空固相微萃取氣相色譜-質(zhì)譜（HS-SPME-GCMS）聯(lián)用的方法[16-17]，對中國、美國和新西蘭Cascade顆粒酒花中香氣化合物的組成進(jìn)行檢測分析，分別與Cascade酒花在麥汁時(shí)添加酒花酒樣的香氣化合物和啤酒儲存期干投后酒樣的香氣化合物進(jìn)行對比分析，同時(shí)分別進(jìn)行感官品評。既能夠?qū)θ齻€(gè)國家的Cascade酒花的香氣化學(xué)成分進(jìn)行檢測對比，又可以對添加該酒花的啤酒進(jìn)行感官分析對比。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2016年份Cascade酒花：分別產(chǎn)自中國新疆地區(qū)、美國俄勒岡州產(chǎn)區(qū)、新西蘭。均使用鋁箔袋抽真空并冷凍保存于冰箱。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀、5975C質(zhì)譜儀、HP-5（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）：美國Agilent公司[18]；聚二甲基硅氧烷StableFlex固相萃取頭：Sigma-Aldrich公司；DVB-CAR-PDMS型頂空固相微萃取裝置：美國Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 頂空固相微萃取（HS-SPME）法提取顆粒酒花香氣成分

準(zhǔn)確稱取8.0 g酒花顆粒樣品，粉碎后立即置于50 mL頂空樣品瓶中，密封瓶口，將樣品置于恒溫水浴鍋中，50℃預(yù)熱5 min。然后連接固相微萃取裝置對酒花香氣成分進(jìn)行吸附（實(shí)驗(yàn)前先將萃取頭老化5 min），50℃條件下固相微萃取45 min。然后將萃取頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，進(jìn)行解吸。

1.3.2 頂空固相微萃?。℉S-SPME）法提取酒樣中的酒花香氣成分

分別取煮沸時(shí)添加Cascade酒花和干投Cascade酒花的啤酒樣品20 mL，加入50 mL頂空樣品瓶中，放入磁子，密封瓶口，將樣品瓶放在磁力攪拌加熱器上，攪拌速度為200 r/min，40℃預(yù)熱5 min，然后連接固相微萃取裝置對酒花香氣成分進(jìn)行吸附，40℃固相微萃取45 min。然后將萃取頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，進(jìn)行解吸。

1.3.3 感官品評

將三個(gè)國家的Cascade顆粒酒花以及煮沸時(shí)添加酒花的酒樣和干投酒花后的酒樣分別進(jìn)行感官品評。由齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）中德啤酒技術(shù)中心師生和兩位國家級品酒師組成10人（5男5女）品評小組對酒樣進(jìn)行品評。從柑橘香、水果香、花香、草藥香、香料香五個(gè)方面進(jìn)行品評打分，每個(gè)方面為0～5分。

1.3.4 色譜條件

載氣：高純氦氣（He）；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣流速：1 mL/min；分流比：30∶1；柱室程序升溫：初始柱溫40 ℃，保持5 min，以5℃/min速率升至210℃，保持3 min。

質(zhì)譜檢測器，電子電離（electron ionization，EI）源，質(zhì)量掃描范圍（m/z）30～400，四級桿溫度150℃，離子源溫度230℃，傳輸線溫度280℃，電子倍增器電壓1 400 V[19]。

1.3.5 定性及定量方法

定性方法：化合物在GC-MS上的采集信息通過Masshunter Workstation B.03.01數(shù)據(jù)處理軟件處理。美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫2.0檢索。

定量方法：通過Agilent自帶的化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，并用氣相色譜峰面積歸一法定量計(jì)算出各化學(xué)成分在酒花中的峰面積的相對含量[20-21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三個(gè)不同國家Cascade酒花香氣對比分析

在氣相色譜條件下，可以分離出100多種成分，經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索譜庫及人工分析質(zhì)譜圖，并參閱有關(guān)文獻(xiàn)，從新西蘭Cascade酒花鑒定出31種物質(zhì)，美國Cascade酒花鑒定出23種物質(zhì)，中國Cascade酒花鑒定出17種物質(zhì)，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，相比較于新西蘭Cascade酒花，中國Cascade酒花沒有檢測到α-蒎烯、依蘭烯、α-金合歡烯、α-杜松烯、羅勒烯，異丁酸異戊酯、異丁酸-2-甲基丁酯、2-甲基丁酸香葉酯、丁酸香葉酯，芳樟醇、香葉醇，2-十一酮、2-十三酮以及γ-亞麻酸。美國Cascade酒花沒有檢測到異丁酸異丁酯、異丁酸-2-甲基丁酯、4-癸烯酸甲酯、2-甲基丁酸香葉酯，羅勒烯、α-杜松烯，2-十三酮及γ-亞麻酸。中國Cascade酒花香味物質(zhì)沒能完全體現(xiàn)Cascade酒花作為苦香兼優(yōu)酒花的功效。

表1 三個(gè)不同國家的Cascade顆粒酒花香氣成分Table 1 Aroma compounds of granular Cascade hops from three different countries

2.2 三個(gè)不同國家酒花在煮沸時(shí)添加酒樣酒花香氣對比分析

在氣相色譜條件下，經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索譜庫及人工分析質(zhì)譜圖，并參閱有關(guān)文獻(xiàn)，在煮沸過程中添加Cascade酒花，新西蘭鑒定出17種香氣物質(zhì)，美國酒花鑒定出7種香氣物質(zhì)，中國酒花鑒定出10種香氣物質(zhì)。結(jié)果如表2所示。

由表2可知，在煮沸時(shí)添加酒花，酒樣中的香氣物質(zhì)都比較少。相比較，酒樣中酒花香氣物質(zhì)含量最豐富的是新西蘭Cascade酒花，香氣物質(zhì)含量居中的是中國Cascade酒花，香氣物質(zhì)含量最少的是美國Cascade酒花。相比較于煮沸時(shí)添加的新西蘭Cascade酒花，中國Cascade酒花在煮沸時(shí)添加檢測到異戊醛和2-甲基丁醛兩種香味物質(zhì)。異戊醛天然存在于柑桔、檸檬等精油中。高度稀釋時(shí)有似蘋果香氣，質(zhì)量濃度＜10.0 mg/L時(shí)呈桃子香味。說明中國Cascade酒花煮沸后會產(chǎn)生新的柑橘、檸檬、蘋果或桃子的香味。沒有檢測到丙酸-2-甲基丁酯、異丁酸異戊酯、異戊酸-2-甲基丁酯、4-癸烯酸甲酯、香葉酸甲酯、乙酸香葉酯、丁酸香葉酯，2-十一酮及氧化石竹烯。美國Cascade酒花只檢測到丙酸-2-甲基丁酯、異丁酸-2-甲基丁酯，月桂烯、d-檸烯、石竹烯、葎草烯及芳樟醇?？傊?，Cascade酒花不適合在煮沸鍋中加入，香氣物質(zhì)損失很大，可以嘗試其他添加方法，會使酒花利用率提高。

表2 煮沸時(shí)添加三個(gè)不同國家的Cascade酒花的酒樣香氣成分Table 2 Aroma compounds of beer samples adding Cascade hops from three different countries during boiling

2.3 三個(gè)不同國家酒花干投后酒樣香氣物質(zhì)對比分析

在氣相色譜條件下，經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索譜庫及人工分析質(zhì)譜圖，并參閱有關(guān)文獻(xiàn)，新西蘭Cascade酒花在儲存期干投后酒樣酒花香氣物質(zhì)鑒定出27種物質(zhì)，美國Cascade酒花干投后酒樣酒花香氣物質(zhì)鑒定出23種物質(zhì)，中國Cascade酒花干投后酒樣酒花香氣物質(zhì)鑒定出20種物質(zhì)。結(jié)果如表3所示。

由表3可知，干投Cascade酒花后，相比較于新西蘭Cascade酒花，美國Cascade酒花檢測到丙醇、2-十一酮、β-瑟林烯三種新西蘭Cascade酒花中沒有的物質(zhì)。而未檢測到乙酸-2-甲基丁酯、異丙酸異丁酯、丙酸-3-甲基丁酯、異丁酸-2-甲基丁酯、4-癸烯酸甲酯、乙酸香葉酯、丁酸芳樟酯。中國Cascade酒花檢測到丙醇一種新西蘭Cascade酒花中沒有的物質(zhì)。而未檢測到異丙酸異丁酯、丙酸-3-甲基丁酯、異丁酸異戊酯、4-癸烯酸甲酯、丁酸芳樟酯，D-檸烯、β-瑟林烯、α-瑟林烯、δ-杜松烯烯類物質(zhì)以及2-十一酮?？傊?，干投后Cascade酒花的香氣都得到了很好的體現(xiàn)。三個(gè)國家的Cascade酒花較適合干投，干投酒花的利用率最高。

表3 三個(gè)不同國家的Cascade酒花干投后酒樣中香氣物質(zhì)Table 3 Aroma compounds of beer samples dry hopping Cascade hops from three different countries

2.4 三個(gè)國家的Cascade酒花香氣及其酒樣的感官品評

Cascade顆粒酒花中，新西蘭酒花的柑橘香、水果香和香料香較突出；煮沸過程中添加Cascade酒花，中國酒花的水果香和柑橘香較突出，美國酒花的草藥香較突出；在儲存期干投Cascade酒花，新西蘭酒花的柑橘香、水果香較突出，美國酒花的草藥香和香料香較突出。Cascade酒花香氣及其酒樣的感官品評的香氣雷達(dá)圖如圖1所示。

圖1 顆粒酒花香氣（A）、煮沸時(shí)添加酒花酒樣香氣（B）、干投酒花酒樣香氣（C）雷達(dá)圖Fig.1 Aroma radar map of granular Cascade hops(A)and beer samples adding hops during boiling(B)and dry hopping(C)

由Cascade酒花香氣雷達(dá)圖（圖1）可知，Cascade酒花不適合在煮沸時(shí)添加，適合干投，干投可以將酒花的香氣物質(zhì)很好的體現(xiàn)在酒樣中。Cascade酒花及酒樣的感官品評結(jié)果與GC-MS檢測的結(jié)果基本相符合。

2.5 三個(gè)國家的Cascade酒花及酒樣香氣物質(zhì)數(shù)量變化

三個(gè)國家的Cascade顆粒酒花香氣物質(zhì)以及在煮沸時(shí)添加酒花酒樣中的酒花香氣物質(zhì)和在儲存期干投酒花檢測到的酒花香氣物質(zhì)數(shù)量對比如圖2所示。

圖2 Cascade酒花及其酒樣香氣物質(zhì)種類變化Fig.2 Quantity changes of aroma compounds in Cascade hops and beer samples

與Cascade顆粒酒花的香氣化合物相比較，新西蘭Cascade酒花在麥汁煮沸過程中添加香氣化合物減少17種，增加3種，在啤酒儲存期干投香氣物質(zhì)減少19種，增加12種；美國Cascade酒花在麥汁煮沸過程中添加香氣化合物減少18種，增加2種，在啤酒儲存期干投香氣物質(zhì)減少12種，增加12種；中國Cascade酒花在麥汁煮沸過程中添加香氣化合物減少12種，增加5種，在啤酒儲存期干投香氣物質(zhì)減少11種，增加14種。減少的主要是萜烯類物質(zhì)，增加的主要是醇和酯類物質(zhì)。Cascade酒花更適合干投，不適合添加到煮沸鍋中。干投可以提高Cascade酒花的利用率。

3 結(jié)論

Cascade顆粒酒花香氣化合物主要包括β-蒎烯、月桂烯、D-檸烯、香葉酸甲酯、古巴烯、乙酸香葉酯、石竹烯、蓽澄茄烯、香檸檬烯、β-金合歡烯、葎草烯、杜松烯、瑟林烯等物質(zhì)。新西蘭Cascade顆粒酒花酒花鑒定出31種物質(zhì)，美國Cascade酒花鑒定出23種物質(zhì)，中國Cascade酒花鑒定出17種物質(zhì)。新西蘭Cascade顆粒酒花的香氣物質(zhì)最豐富。與Cascade顆粒酒花的香氣化合物相比較，新西蘭Cascade酒花在麥汁煮沸過程中添加和在啤酒儲存期干投的香氣物質(zhì)減少的主要是萜烯類物質(zhì)，增加的主要是醇和酯類物質(zhì)。感官品評方面，在麥汁煮沸過程中添加酒花，中國的Cascade酒花具有突出的柑橘、檸檬、蘋果或桃子的香味；在啤酒儲存期干投Cascade酒花，生成較多的醇類物質(zhì)，酒花的利用率較高。

同樣品種不同國家種植的酒花，酒花香氣物質(zhì)不完全相同，酒花的香氣物質(zhì)的影響因素很多?？赡芘c年份、地理環(huán)境、土壤條件和氣候環(huán)境等有關(guān)。具體影響酒花香氣物質(zhì)的因素有待進(jìn)一步研究。為酒花香氣物質(zhì)的形成研究提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。