部分稀土元素對(duì)靈芝多糖和三萜類(lèi)物質(zhì)液體發(fā)酵的影響

姚 強(qiáng)，高興喜*，宮志遠(yuǎn)，任鵬飛，仇可新，劉 巖

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109)

部分稀土元素對(duì)靈芝多糖和三萜類(lèi)物質(zhì)液體發(fā)酵的影響

姚 強(qiáng)1，高興喜2,*，宮志遠(yuǎn)1，任鵬飛1，仇可新2，劉 巖3

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，山東 濟(jì)南 250100；2.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109)

研究5種稀土元素(鑭(La)、鈰(Ce)、釹(Nd)、鐠(Pr)、鉺(Er))對(duì)靈芝液體發(fā)酵生產(chǎn)靈芝多糖產(chǎn)量和靈芝三萜類(lèi)物質(zhì)的影響。結(jié)果表明：不同的稀土元素在適宜濃度時(shí)對(duì)靈芝多糖和靈芝三萜的產(chǎn)量均具有一定程度的促進(jìn)作用。其中稀土元素鐠對(duì)靈芝胞內(nèi)多糖、胞外多糖和胞內(nèi)三萜的生產(chǎn)促進(jìn)作用最明顯，分別在濃度為0.01、0.001mmol/L和0.1mmol/L時(shí)，使三者產(chǎn)量分別達(dá)到最高的772.56、452.76mg/L和398.49mg/L，分別是對(duì)照的4.67、3.05和1.91倍；而對(duì)于胞外三萜，0.001mmol/L的鑭誘導(dǎo)效果最好，其產(chǎn)量達(dá)到610.08mg/L，是對(duì)照的2.03倍?？梢?jiàn)適宜的稀土元素及濃度可顯著提高靈芝多糖和靈芝三萜的生產(chǎn)。

稀土元素；靈芝；多糖；三萜

靈芝(Ganoderma lucidum Karst)古稱(chēng)瑞草，是一種名貴的藥用真菌，至今已有2000多年的藥用歷史。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，靈芝具有免疫調(diào)節(jié)[1]、抗腫瘤[2-3]、保肝護(hù)肝[4]、抗病毒[5]等多種功效，其藥理活性與其關(guān)鍵藥效成分靈芝多糖和三萜類(lèi)物質(zhì)密切相關(guān)[6-7]。采用液體發(fā)酵的方法獲取靈芝有效成分具有很好的工業(yè)化應(yīng)用前景，然而產(chǎn)量偏低成為主要限制因素[8]。因此，如何有效提高靈芝等食藥用菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量一直是人們研究的熱點(diǎn)。

稀土元素是化學(xué)元素周期表中鑭系元素及兩個(gè)相關(guān)元素鈧和釔的總稱(chēng)，具有廣泛的生物學(xué)功能，能夠促進(jìn)植物的生長(zhǎng)以及細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的合成[9-10]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，稀土元素還能夠促進(jìn)蒙古口蘑[11]、杏鮑菇[12]、靈芝[13]等食用菌的菌絲生長(zhǎng)，對(duì)紅菇多糖深層發(fā)酵也具有一定的促進(jìn)作用[14]。另外，在靈芝的栽培生產(chǎn)中，向培養(yǎng)料中添加稀土微肥還能夠顯著提高靈芝的產(chǎn)量[15]和品質(zhì)[16]。目前，關(guān)于稀土元素對(duì)靈芝活性成分液體發(fā)酵影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)[9-10,13-14]，選擇對(duì)植物或食用菌細(xì)胞生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物合成具有明顯促進(jìn)作用的5種稀土元素(硝酸鑭、硝酸鈰、硝酸釹、硝酸鐠和硝酸鉺)，分別考察它們(La、Ce、Nd、Pr、Er)對(duì)靈芝多糖和三萜類(lèi)物液體發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝菌株Gl-01為昆崳山野生菌株，由魯東大學(xué)食用菌工程技術(shù)研究中心保存。

稀土元素硝酸鑭、硝酸鈰、硝酸釹、硝酸鐠、硝酸鉺 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；香蘭素 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品 煙臺(tái)市藥品檢驗(yàn)所；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與發(fā)酵培養(yǎng)

將靈芝斜面菌種在PDA平板上活化，25℃培養(yǎng)7d左右，待長(zhǎng)滿(mǎn)平板后，用打孔器打取菌塊接種于200mL PDB培養(yǎng)基，于25℃、150r/min振蕩培養(yǎng)5～7d，制備液體菌種用于下一步發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

分別配制含有各稀土元素濃度梯度為0、0.001、0.01、0.1mmol/L的PDB培養(yǎng)基(500mL三角瓶裝液量200mL)，每個(gè)濃度進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，高壓蒸汽滅菌。然后按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量將靈芝種子液接入各培養(yǎng)基中，置于25℃、150r/min的搖床中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為7d左右。

1.2.2 靈芝生物量測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后收集菌體，并用去離子水洗滌菌體3次，65℃烘干至恒定質(zhì)量后測(cè)量干質(zhì)量。

1.2.3 靈芝多糖和三萜類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定

[17]方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀土元素對(duì)靈芝生物量的影響

圖1 稀土元素對(duì)靈芝生物量的影響Fig.1 Effects of rare earth elements on biomass of Ganoderma lucidum

如圖1所示，5種稀土元素對(duì)靈芝生物量體現(xiàn)出不同的影響，其中稀土元素鈰(Ce)和釹(Nd)在不同測(cè)定濃度時(shí)都具有較明顯的促進(jìn)作用，且在0.01mmol/L時(shí)，促進(jìn)效果最明顯，與對(duì)照組相比分別提高了19.8%和19.6%；而稀土元素鐠(Pr)只有在較高濃度時(shí)促進(jìn)效果才顯著，在濃度為0.1mmol/L時(shí)，比對(duì)照組提高了36.9%。稀土元素鉺(Er)和鑭(La)對(duì)靈芝生物量的作用不明顯。

2.2 稀土元素對(duì)靈芝胞內(nèi)多糖生產(chǎn)的影響

圖2 稀土元素對(duì)靈芝胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of rare earth elements on IPS production

由圖2可知，稀土元素鐠對(duì)靈芝胞內(nèi)多糖(intracellular polysaccharide，IPS)的產(chǎn)量促進(jìn)效果最顯著，當(dāng)鐠在濃度為0.01mmol/L時(shí)，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到772.56mg/L，與對(duì)照組相比提高了4.67倍；其次是稀土元素釹，在濃度0.1mmol/L時(shí)，胞內(nèi)多糖產(chǎn)量達(dá)到514.12mg/L，是對(duì)照組的3.10倍。其他稀土元素對(duì)靈芝胞內(nèi)多糖生產(chǎn)促進(jìn)作用不顯著。

2.3 稀土元素對(duì)靈芝胞外多糖生產(chǎn)的影響

5種稀土元素除鉺之外，其他幾種在適宜濃度都能促進(jìn)靈芝胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)的生產(chǎn)，結(jié)果如圖3所示。其中稀土元素鐠促進(jìn)效果最顯著，當(dāng)鐠在濃度0.001mmol/L時(shí)，靈芝胞外多糖產(chǎn)量為452.76mg/L，是對(duì)照組的3.05倍；其次，稀土元素釹對(duì)靈芝胞外多糖生產(chǎn)促進(jìn)效果最好，在濃度為0.01mmol/L時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到355.74mmol/L，是對(duì)照組的2.40倍；稀土元素鈰在濃度為0.001mmol/L時(shí)也具有較好的促進(jìn)作用；而稀土元素鑭和鉺作用效果不顯著，甚至出現(xiàn)高濃度抑制現(xiàn)象。

圖3 稀土元素對(duì)靈芝胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of rare earth elements on EPS production

2.4 稀土元素對(duì)靈芝胞內(nèi)三萜生產(chǎn)的影響

圖4 不同稀土元素對(duì)靈芝胞內(nèi)三萜產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of rare earth elements on IGT production

稀土元素對(duì)靈芝胞內(nèi)三萜(intracellular triterpenoid，IGT)產(chǎn)量的影響因稀土元素的種類(lèi)和濃度呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，如圖4所示。其中稀土元素釹、鈰、鐠和鑭對(duì)靈芝胞內(nèi)三萜的生產(chǎn)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，特別是稀土元素釹、鐠和鑭，促進(jìn)作用顯著，其中釹在濃度為0.001mmol/L，鑭和鐠在濃度為0.1mmol/L時(shí)，胞內(nèi)三萜的產(chǎn)量分別達(dá)到341.05、347.59mg/L和398.49mg/L，分別為對(duì)照的1.64倍、1.67倍和1.91倍。而稀土元素鉺對(duì)靈芝胞內(nèi)三萜的生產(chǎn)不但沒(méi)有促進(jìn)作用，還表現(xiàn)為低濃度抑制。

2.5 稀土元素對(duì)靈芝胞外三萜生產(chǎn)的影響

稀土元素對(duì)靈芝胞外三萜(extracellular triterpenoid，EGT)生產(chǎn)的影響與胞內(nèi)三萜呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，如圖5所示。對(duì)胞外三萜生產(chǎn)促進(jìn)效果最好的稀土元素為鑭和釹，且最佳濃度均為0.001mmol/L，相應(yīng)胞外三萜產(chǎn)量分別達(dá)到610.08mg/L和489.22mg/L，分別為對(duì)照的2.03倍和1.63倍。而其他幾種稀土元素對(duì)靈芝胞外三萜生產(chǎn)的促進(jìn)作用不明顯，甚至表現(xiàn)出高濃度抑制作用。

圖5 稀土元素對(duì)靈芝胞外三萜產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of rare earth elements on EGT production

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，稀土元素對(duì)靈芝多糖和三萜類(lèi)物質(zhì)液體發(fā)酵的影響，與稀土元素的種類(lèi)和濃度密切相關(guān)，綜合來(lái)看稀土元素鐠和釹對(duì)靈芝多糖的誘導(dǎo)效果最好，而稀土元素釹、鑭和鈰對(duì)靈芝三萜誘導(dǎo)效果最好。李增利[14]在研究稀土元素對(duì)紅菇多糖液體發(fā)酵的影響時(shí)也得出了類(lèi)似的結(jié)論。相對(duì)于靈芝多糖和三萜的生產(chǎn)，靈芝生物量對(duì)稀土元素的誘導(dǎo)作用不甚敏感，甚至表現(xiàn)出抑制作用，這與郭麗瓊等[15]、李增利等[14]的研究結(jié)果基本一致。

稀土元素的作用機(jī)制可能類(lèi)似于激素，因其具有類(lèi)似鈣的原子結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)，可通過(guò)激活相應(yīng)的酶系統(tǒng)而發(fā)揮作用[10,14]。然而，當(dāng)稀土元素的濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)類(lèi)似重金屬離子的特性，并與膜蛋白結(jié)合抑制有關(guān)酶的活性[10]。本研究中，稀土元素鐠、釹、鑭等對(duì)靈芝胞外多糖、胞內(nèi)多糖以及胞外三萜的合成表現(xiàn)出的高濃度抑制，可能正是緣于此。

本研究?jī)H就稀土元素對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)以及靈芝多糖和三萜類(lèi)物質(zhì)合成的影響進(jìn)行了探討，而對(duì)稀土元素的作用機(jī)制，特別是稀土元素對(duì)靈芝多糖和三萜類(lèi)物質(zhì)等活性成分合成的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步的深入研究。

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Effects of Some Rare Earth Elements on Liquid Fermentation of Ganoderma lucidum to Produce Polysaccharides and Triterpenoids

YAO Qiang1，GAO Xing-xi2,*，GONG Zhi-yuan1，REN Peng-fei1，QIU Ke-xin2，LIU Yan3
(1. Soil and Fertilizer Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China；2. School of Life Sciences,Ludong University, Yantai 264025, China；3. School of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

In this study, the effects of some rare earth elements such as La3+, Ce3+, Nd3+, Pr3+and Er3+on the production of polysaccharides and triterpenoids by liquid fermentation of Ganoderma lucidum were explored. The results indicated that obvious stimulation effects of these rare earth elements on the production of polysaccharides and tritepenoids were observed. Moreover,Pr3+at concentrations of 0.01, 0.001 mmol/L and 0.1 mmol/L revealed the most obvious improvement on the production of intracellular polysaccharides (IPS), extracellular polysaccharides (EPS) and intracellular triterpenoids (IGT) with yields of 772.56, 452.76 mg/L and 398.49 mg/L, respectively. Compared with the control group, three components were increased by 4.67, 3.05 folds, and 1.91 folds due to Pr3+treatment. However, La3+at a concentration of 0.001 mmol/L showed a remarkable enhancing effect on EPS and the yield of EPS was up to 610.08 mg/L with a 2.03-fold enhancement. Therefore, the rare earth elements at appropriate concentrations can obviously increase the production of polysaccharides and triterpenoids in Ganoderma lucidum during liquid fermentation.

rare earth elements；Ganoderma lucidum；polysaccharides；triterpenoids

Q93.335

A

1002-6630(2011)05-0224-04

2010-07-20

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Q2008D02；ZR2010CL020)；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD89B09-11)；

山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目(2007LZ06-3)；“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目；魯東大學(xué)食(藥)用真菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

姚強(qiáng)(1979—)，男，助理研究員，博士，主要從事分子育種、微生物生理生化研究。E-mail：qyaomail@163.com

*通信作者：高興喜(1972—)，男，副教授，博士，主要從事高等真菌分子生物學(xué)與代謝生理研究。E-mail：gaoxingxi@yahoo.com.cn