酸性植酸酶產生菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究

李 文，王 陶

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

酸性植酸酶產生菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件研究

李 文，王 陶

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

從土壤中篩選到一株產酸性植酸酶酶活較高的菌株，初步鑒定為黑曲霉，菌株最優(yōu)發(fā)酵條件為：麩皮3g/100mL、(NH4)2SO4 0.5g/100mL、發(fā)酵液初始pH5.5、發(fā)酵時間84h，酶活力可達12.06U/mL。對其粗酶液的酶學性質研究表明：該酶最適作用pH值為5左右，最適溫度是45℃；該酶在55℃保溫30min后酶活力保留在60%左右；在酸性和中性條件下有一定的穩(wěn)定性；金屬離子Ca2+、 Fe2+、Na+、K+、Zn2+、Cu2+對酶有一定的抑制作用，Mg2+、Ba2+對酶有一定的激活作用。

酸性植酸酶；篩選；發(fā)酵；酶學性質

近年來，飼用酶制劑以其高效、安全、低成本等特點，已成為飼料添加劑研究和應用的熱點[1]。植酸酶就是其中之一。谷物飼料中50%～70%的磷是以植酸鹽(肌醇六磷酸鹽)的形式存在，單胃動物不能或很少分泌分解植酸的酶，使得人和動物內鈣、鎂、鐵、鋅等微量礦物質元素失衡[2-3]，植酸直接排出體外，又可導致水體的富營養(yǎng)化，對環(huán)境造成嚴重的磷污染[4-6]。植酸酶(EC.3.1.3.8)可催化肌醇六磷酸(鹽或酯)脫掉磷酸基團[7]，從而提高飼料中磷的利用率，減少磷的排放，解除植酸鹽的抗營養(yǎng)作用[8-9]。目前，植酸酶已經(jīng)開始試用在植物性食品中，達到分解植酸磷，平衡營養(yǎng)的作用[10]。

植酸酶廣泛存在于動植物組織和微生物細胞中。產植酸酶的微生物有細菌、酵母和真菌等[7]。由于來源于

微生物的植酸酶作用范圍和穩(wěn)定性較好，易規(guī)?；a，近幾年的研究大都集中在微生物來源植酸酶[11]。根據(jù)最適pH值的不同，植酸酶可分為酸性植酸酶、中性植酸酶和堿性植酸酶[12]，其中，酸性植酸酶的酶促反應的pH值有效作用范圍在2.5～5.5之間，適用于胃pH值呈酸性的單胃動物以及少數(shù)魚類如虹鱒等[13]，能有效作用于單胃動物的消化道。故此，本實驗擬從徐州地區(qū)的土壤中分離篩選產酸性植酸酶酶活較高的菌株，對其進行鑒定，并研究其酶學性質和發(fā)酵條件，以期為酸性植酸酶的應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土樣：采自徐州市樹林、菜地、動物園等處。

植酸鈣 丹徒第一化工廠；植酸鈉 美國Sigma公司；四水合鉬酸銨 合肥工業(yè)大學化學試劑廠；三氯乙酸 天津市河東區(qū)紅巖試劑廠；苯酚 天津市永大化學試劑開發(fā)中心；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；HYG旋式恒溫調速搖瓶柜 上海欣蕊自動化設備有限公司；DL-5低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 酸性植酸酶產生菌的初篩

1.3.1.1 初篩培養(yǎng)基

植酸鈣1g/100mL、葡萄糖3g/100mL、NH4NO30.5g/100mL、KCl 0.05g/100mL、MgSO4·7H2O 0.05g/100mL、MnSO4·H2O 0.0018g/100mL、FeSO4·7H2O 0.003g/100mL、瓊脂1.5g/100mL，pH5.5。同時制作pH4.5、pH3.5和pH2.5的初篩培養(yǎng)基。

1.3.1.2 初篩過程

取5g土樣于45mL有玻璃珠的無菌生理鹽水，于100r/min的搖床上振蕩30min，靜置，取上清液原液以及10-1、10-2的稀釋液涂布初篩平板，于28℃條件下培養(yǎng)3～5d，從第24小時起以每12h觀察透明圈產生情況，挑取透明圈直徑與菌落直徑比大的菌落于查氏培養(yǎng)基斜面(29±1)℃培養(yǎng)3～5d。

1.3.2 酸性植酸酶產生菌的復篩

1.3.2.1 復篩培養(yǎng)基

葡萄糖3g/100mL、(NH4)2SO40.2g/100mL、蛋白胨0.3g/100mL、KCl 0.05g/100mL、MgSO4·7H2O 0.05g/100mL、MnSO4·H2O 0.0018g/100mL、FeSO4·H2O 0.003g/100mL，pH5.5。

1.3.2.2 復篩過程

將菌株接種于錐形瓶中，于28℃、150r/min搖床培養(yǎng)3d。

1.3.3 酸性植酸酶活性的測定

植酸酶活性的測定參照文獻[14]的方法進行。

酶活力單位定義：在溫度37℃、pH5.5條件下，每分鐘從濃度為5.0mmol/L植酸鈉溶液中釋放lμmol無機磷即為一個植酸酶活性單位，以U表示。

1.3.4 菌種遺傳穩(wěn)定性檢測

將高產菌株連續(xù)傳6代，分別搖瓶發(fā)酵測酶活力，檢測菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.5 菌種的初步鑒定

觀察菌落形態(tài)及菌絲形態(tài)，依據(jù)《真菌鑒定手冊》鑒定菌種。

1.3.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.6.1 碳源種類的優(yōu)化

考察葡萄糖、蔗糖、乳糖、麩皮對酶活力的影響，取酶活力最大值所對應的碳源為最適碳源。

1.3.6.2 碳源質量濃度的優(yōu)化

考察質量濃度分別為2、3、4、5、6g/100mL的碳源對酶活力的影響，取酶活最大值所對應的質量濃度作為最適碳源質量濃度。

1.3.6.3 氮源質量濃度的優(yōu)化

改變(NH4)2SO4的質量濃度為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/100mL，分別進行酶活力測定，取酶活力最大時所對應的條件作為最適氮源質量濃度。

1.3.6.4 培養(yǎng)基初始pH值的優(yōu)化

考察培養(yǎng)基初始pH值為3、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7對酶活力的影響，取酶活力最大值所對應的pH值為發(fā)酵最適初始pH值。

1.3.6.5 培養(yǎng)時間的優(yōu)化

從第24小時開始，每12h進行酶活力測定，以酶活力最高時的時間為最優(yōu)發(fā)酵時間。

1.3.7 酸性植酸酶的酶學性質

1.3.7.1 酶作用的最適pH值

將植酸鈉溶液用緩沖液配制成不同的pH值(1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0)作為底物進行酶促反應，測定粗酶液的酶活。以最高酶活力為100%，在其他條件的酶活力占最高酶活力的百分數(shù)即為該酶在此pH值條件的相對酶活力。最高酶活力時的pH值即為最適pH值。

1.3.7.2 酶的pH值穩(wěn)定性

采用不同pH值(1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0)的緩沖液在37℃條件下處理酶溶液30min和60min，然后調回最適pH值，在常規(guī)條件下測定酶活力，并計算相對酶活力，考察酶在37℃條件下的pH值穩(wěn)定性。

1.3.7.3 酶作用的最適溫度

在不同溫度條件下(25、35、37、45、55、65、75℃)進行酶促反應，測定酶活力。最高酶活力時的溫度即為酶作用的最適溫度。

1.3.7.4 酶的熱穩(wěn)定性

在不同溫度條件下(35、45、50、55、60、65℃)處理粗酶液30min和60min，再在37℃條件下進行酶活力測定。

1.3.7.5 金屬離子對酶活力的影響

在植酸鈉溶液中添加質量濃度為0.1g/100mL的CaCl2、MgSO4、ZnSO4、CuSO4、FeSO4、NaCl、KCl、Ba(OH)2，測定酶活力。研究金屬離子對酶活力的影響。

2 結果與分析

2.1 酸性植酸酶產生菌的篩選與鑒定

圖1 初篩的透明圈Fig.1 Transparent circles observed in primary screening of strains

對學校及學校周圍的林場、菜地等多處取樣地點所取的28批表層土樣本和30批深層土樣本進行篩選，其中表層土樣成功兩批，篩選得到的菌種均為細菌，深層土樣成功8批，篩選得到的菌種有58株霉菌和6株細菌，所有菌株均在pH5.5的篩選培養(yǎng)基上篩到，在pH2.5的篩選培養(yǎng)基上也篩到一株霉菌。透明圈產生情況見圖1。對透明圈與菌落直徑比較大的菌進行液體發(fā)酵，提取粗酶液進行酶活力測定，酶活力較大的7株菌的酶活力見表1。其中1號霉菌的酶活力最高，為9.48U/mL，與其他菌株的酶活力之間具有極顯著差異(P＜0.01)。

圖2 單菌落形態(tài)特征Fig.2 Single colony morphology of strain 1 (with the highest phytase activity)

對1號菌株進行菌種鑒定，單菌落的形態(tài)特征見圖2。菌落在査氏瓊脂上生長迅速，菌落初白色，后變黑，28℃培養(yǎng)7d直徑一般40～50mm，少數(shù)菌株生長較局限；平坦或中心稍凸起，有規(guī)則或不規(guī)則的輻射狀溝紋；質地絲絨狀或稍呈絮狀，有的菌株偶有不育性過度生長；菌落表面有大量孢子，呈暗褐黑色至炭黑色；具有霉味；菌落反面無色或呈不同程度的黃色、黃褐色或帶微黃綠色。通過40倍物鏡觀察到霉菌的顯微結構，見圖3。菌絲有隔膜，梗部有足細胞。有些分生孢子頭分裂成幾個圓柱狀結構，可達500μm，產孢結構雙層。分生孢子頭為球形至輻射性，直徑150～500μm，分生孢子梗壁光滑，長約800～4000μm，頂囊球形或近球形，直徑40～70μm。實驗研究該菌株與標準黑曲霉的個體形態(tài)完全相同[15-16]，綜上特征，此酸性植酸酶產生菌初步鑒定為黑曲霉。

圖3 菌株的個體形態(tài)特征(×400)Fig.3 Individual morphology of strain 1 (×400)

2.2 黑曲霉產酸性植酸酶的遺傳穩(wěn)定性

對篩選得到的黑曲霉進行6次傳代，并分別測其酶活力，結果如表2所示。各代菌株與第一代菌株的酶活力均無顯著性差異(P＞0.05)，表明該菌株有較好的遺傳穩(wěn)定性。

2.3 發(fā)酵條件初步優(yōu)化

2.3.1 不同碳源對植酸酶酶活力的影響

由圖4可以看出，利用麩皮作為產酶培養(yǎng)的碳源，酶活比使用其他碳源物質明顯增高，同比葡萄糖增長30%，可能由于麩皮中含有某種成分，可以刺激黑曲霉分泌植酸酶，故以麩皮作為碳源。

表1 不同菌株所產酸性植酸酶的酶活力Table 1 Enzyme activities of strains producing acid phytase

表2 黑曲霉產酸性植酸酶的遺傳穩(wěn)定性Table 2 Genetic stability of strain 1

圖4 不同碳源對植酸酶酶活力的影響Fig.4 Effect of carbon source on phytase activity

2.3.2 碳源質量濃度對植酸酶酶活力的影響

圖5 麩皮質量濃度對植酸酶酶活力的影響Fig.5 Effect of wheat bran concentration on phytase activity

如圖5所示，隨著麩皮溶液質量濃度的增加，酶活力先上升，后下降，可能因為少量的麩皮對產酶有促進作用，過多的纖維存在對于產酶并沒有明顯的刺激作用，所以利用3g/100mL麩皮作為產酶培養(yǎng)的碳源。

2.3.3 (NH4)2SO4質量濃度對植酸酶酶活力的影響

圖6 (NH4)2SO4質量濃度對植酸酶酶活力的影響Fig.6 Effect of (NH4)2SO4 concentration on phytase activity

如圖6所示，(NH4)2SO4質量濃度為0.5g/100mL時黑曲霉產植酸酶的酶活力最高，質量濃度過高，反而會抑制植酸酶的活力。

2.3.4 培養(yǎng)基初始pH值對植酸酶酶活力的影響

圖7 培養(yǎng)基初始pH值對植酸酶酶活力的影響Fig.7 Effect of initial culture pH on phytase activity

如圖7所示，酸性范圍內，酶活力先上升后下降，黑曲霉產的植酸酶活力在pH5.5的條件下最高，可能由于該株黑曲霉是在pH5.5的條件下篩選得到的，它最適宜這個pH值條件，也說明篩選出的黑曲霉產生的確為酸性植酸酶。故以pH5.5作為培養(yǎng)基的初始pH值。

2.3.5 培養(yǎng)時間對植酸酶酶活力的影響

圖8 培養(yǎng)時間對植酸酶酶活力的影響Fig.8 Effect of culture time on phytase activity

利用最優(yōu)的培養(yǎng)基，觀察培養(yǎng)時間對植酸酶活力的影響，結果見圖8。從第24小時開始，黑曲霉分泌的植酸酶就存在活力了，前60h的活力增長不是很明顯，從第60小時開始，酶活力迅速提高，說明霉菌新增加的細胞數(shù)目和死亡的細胞數(shù)目達到動態(tài)平衡，數(shù)目達到最高峰，細胞開始大量進行累積代謝，當?shù)竭_84h時，酶活力達到了峰值，為12.06U/mL。此后酶活力可能因為代謝活動所必需的物質減少而小范圍的降低，因此，確定最佳發(fā)酵時間為84h。

2.4 酸性植酸酶的酶學性質

2.4.1 酸性植酸酶作用的最適pH值

由圖9可以看出，該酶在pH2和5時酶活力都較高，符合酸性植酸酶的性質。

圖9 pH值對植酸酶酶活力的影響Fig.9 Effect of reaction pH on phytase activity

2.4.2 酸性植酸酶的pH值穩(wěn)定性

圖10 酸性植酸酶的pH值穩(wěn)定性Fig.10 pH stability of phytase

用不同pH值的緩沖液在37℃條件下處理粗酶液30、60min，然后調回最適pH值，在常規(guī)條件下測定酶活力，考察酶在37℃條件下的pH值穩(wěn)定性，結果見圖10。該酶在pH3時，只有40%左右的酶活力，而其他pH值之間均有50%以上的酶活力，延長處理時間，對酶活力的影響不大。此酶在酸性和中性的pH值條件下有一定的穩(wěn)定性。

2.4.3 酸性植酸酶作用的最適溫度

圖11 溫度對植酸酶酶活力的影響Fig.11 Effect of reaction temperature on phytase activity

從圖11可以看出，酸性植酸酶的最適溫度為45℃，在35～55℃都具有較高的酶活力，超過55℃后酶活力迅速下降。

2.4.4 酸性植酸酶的熱穩(wěn)定性

圖12 酸性植酸酶的熱穩(wěn)定性Fig.12 Thermal stability of phytase

從圖12可以看出，在50℃保溫30min后酶活力保留在80%左右，在55℃保溫30min后酶活力仍能保留在60%以上，之后酶活力就迅速降低，65℃幾乎沒有酶活力。延長處理時間對酶的熱穩(wěn)定性影響不大。

2.4.5 金屬離子對酸性植酸酶酶活力的影響

表3 金屬離子對酸性植酸酶酶活力的影響Table 3 Effect of metal ions on phytase activity

由表3可以看出，各種金屬離子與無添加金屬離子的酶活力相比均有顯著性差異。Ca2+、Fe2+、Na+、K+對酶活力有一定的抑制作用，Zn2+、Cu2+對酶有很大的抑制作用，可能這些離子可以和底物植酸鈉發(fā)生很強的絡合作用，是該酶的抑制劑；Mg2+、Ba2+對酶有一定的激活作用，是該酶的激活劑。

3 結 論

從土壤中篩選到一株產酸性植酸酶酶活力較高的菌株，初步鑒定為黑曲霉，對該菌株液體發(fā)酵產酶條件進行初步優(yōu)化，最優(yōu)條件為：麩皮3g/100mL、(NH4)2SO40.5g/100mL、發(fā)酵液初始pH5.5、發(fā)酵時間84h，此時酶活力可達12.06U/mL，此酶活高于目前報道的天然篩選的黑曲霉的酶活力，這可能與此菌株不同的生長環(huán)境有關，或是菌株發(fā)生了突變，使得酶活力較高。此菌株有一定的應用潛力，為下一步的遺傳改良以更進一步的提高酶活力打下很好的基礎。

對該酸性植酸酶粗酶液的酶學性質研究表明：該酶的最適pH值為5左右，最適溫度是45℃；耐熱性方面，該酶在55℃保溫30min后酶活保留在60%左右，之后迅速下降；該酶在酸性和中性條件下有一定的穩(wěn)定性；金屬離子 Ca2+、Fe2+、Na+、K+、Zn2+、Cu2+對酶有一定的抑制作用，Mg2+、Ba2+對酶有一定程度的激活作用，因此，可考慮在發(fā)酵時加入這些金屬離子，以增大酶活力。另外，為適應飼料制粒過程中的高溫過程，可對該酸性植酸酶的耐熱性進行遺傳改良，以更好地發(fā)揮其作用。

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Screening and Identification of a Strain Capable of Producing Acid Phytase and Optimization of Its Fermentation Conditions

LI Wen，WANG Tao
(College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

A strain with higher acid phytase activity isolated from soil was identified as Aspergillus niger. The optimal fermentation conditions for improved production of phytase by the strain were incubation in a medium composed of 3 g/100mL wheat bran and 0.5 g/100mL (NH4)2SO4, at an initial pH of 5.5 for 84 h. Under the optimal fermentation conditions, the phytase activity was up to 12.06 U/mL. The optimal reaction pH and temperature of this enzyme were 5 and 45 ℃, respectively. The relative enzyme activity remained to be 60% after heating treatment at 55 ℃ for 30 min. In addition, the enzyme was stable in acidic and neutral media. The phytase activity was inhibited by Ca2+, Fe2+, Na+, K+, Zn2+and Cu2+, while activated by Mg2+and Ba2+.

acid phytase；screening；fermentation；enzyme property

Q93.331

A

1002-6630(2011)05-0228-06

2010-06-21

江蘇省高校自然科學研究面上項目(10KJD180006)；徐州工程學院科研基金青年課題(XKY2009122)

李文(1982—)，女，講師，碩士，研究方向為微生物發(fā)酵。E-mail：wenlisony@126.com