瑣瑣葡萄總黃酮在體外對(duì)乙型肝炎病毒的影響

劉 濤，馬 龍,*，趙 軍，李海波

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊830004；3.江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南通 226006)

瑣瑣葡萄總黃酮在體外對(duì)乙型肝炎病毒的影響

劉 濤1，馬 龍1,*，趙 軍2，李海波3

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊830004；3.江蘇省南通市疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南通 226006)

目的：考察瑣瑣葡萄總黃酮體外抗乙型肝炎病毒(HBV)的效果。方法：用HBV DNA轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞所得的HepG 2.2.15細(xì)胞株為模型，ELISA法測(cè)定用藥后8d細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg含量，計(jì)算瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HBsAg和HBeAg分泌的抑制率，熒光定量PCR法測(cè)定HBV DNA的變化，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞毒性。結(jié)果：瑣瑣葡萄總黃酮在12.5～100μg/mL范圍內(nèi)，均能不同程度地減少細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的含量，且細(xì)胞毒性小，半數(shù)中毒劑量(TC50)為284.91μg/mL，對(duì)HBsAg半數(shù)有效劑量(IC50)為327.56μg/mL、對(duì)HBeAg為215.34μg/mL，對(duì)HBsAg治療指數(shù)(TI)為0.87、對(duì)HBeAg治療指數(shù)為1.32；總黃酮質(zhì)量濃度100μg/mL時(shí)對(duì)HBV DNA的抑制率為47.63%。結(jié)論：瑣瑣葡萄總黃酮具有一定的體外抗HBV作用。

瑣瑣葡萄；總黃酮；乙型肝炎病毒；細(xì)胞培養(yǎng)

乙型肝炎病毒(HBV)感染不僅會(huì)導(dǎo)致急慢性乙型肝炎的發(fā)生，而且與肝硬化、原發(fā)性肝癌關(guān)系密切。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)傳統(tǒng)天然藥物的抗病毒研究日益重視，抗乙肝病毒藥物研究雖然取得了一些進(jìn)展，但目前仍缺乏比較理想的治療藥物[1]。因此，從豐富的中草藥植物資源中尋找新的有效抗HBV藥物，已成為我國(guó)抗病毒中藥發(fā)展的必然趨勢(shì)。1987年，美國(guó)Sells等[2]將帶有HBV DNA全基因組及抗G418的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株Hep G建立了2.2.15細(xì)胞株，它能長(zhǎng)期穩(wěn)定地向細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane’s顆粒，是目前體外篩選和評(píng)價(jià)抗乙肝病毒藥物較理想的細(xì)胞模型[3]。黃酮是維吾爾藥瑣瑣葡萄(Vitis vinifer L.)的主要組成成分之一[4]，具有調(diào)節(jié)免疫[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、抗病毒[8]、抗輻射[9]等多種生物活性。課題組前期研究顯示瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)免疫性肝損傷具有較好的保護(hù)作用[10]，且對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖具有顯著的抑制作用[11]。為探討瑣瑣葡萄總黃酮的抗HBV效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)以Hep G 2.2.15細(xì)胞株為模型，研究瑣瑣葡萄總黃酮在體外抗HBV的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG 2.2.15細(xì)胞株購(gòu)自武漢大學(xué)物種保藏中心，傳代于高糖DMEM培養(yǎng)基(每1000mL含100萬(wàn)單位青霉素、1.0g鏈霉素、100mg G418和10%滅活胎牛血清)中培養(yǎng)。

DMEM培養(yǎng)基、G418(Geneticin)、青霉素-鏈霉素美國(guó)Gibco公司；胎牛血清 杭州四季青生物制品公司；HBsAg和HBeAg ELISA檢測(cè)試劑盒 上海華美生物工程公司；HBV DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒 上海申友生物技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)(MTT) 美國(guó)Amresco公司；二甲基亞砜(DMSO)、0.025%胰蛋白酶-EDTA美國(guó)Sigma公司；拉米夫定(3-TC，批號(hào)06120028) 葛蘭素史克制藥蘇州有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Napco公司；XD-2倒置顯微鏡重慶光電儀器有限公司；生物安全柜 美國(guó)Labconco公司；XD 711型酶標(biāo)儀 上海迅達(dá)醫(yī)療器械有限公司；Thermo IEC冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)熱電公司；Opticon實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)MJ Research公司；AB104-N型分析天平 Mettler-Toledo上海有限公司。

1.3 瑣瑣葡萄總黃酮的制備

瑣瑣葡萄藥材粉碎后以去離子水回流提取2次，每次1h，合并提取液，減壓濃縮至一定量，加入5倍體積95%乙醇，充分混勻，靜置12h，過(guò)濾得濾液A。藥渣以8倍量95%乙醇回流提取2次，每次1h，合并提取液，減壓濃縮至浸膏，浸膏以水混懸后，石油醚萃取脫脂，再經(jīng)乙酸乙酯萃取，其中乙酸乙酯部分減壓濃縮后，以95%乙醇溶解，放置12h，析出沉淀，過(guò)濾得濾液B；濾液A、濾液B及乙酸乙酯萃取后液體合并，減壓濃縮，上AB-8 型大孔吸附樹脂，依次以水、50%和95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，收集50%乙醇洗脫餾分，減壓濃縮，真空干燥，即得瑣瑣葡萄總黃酮。按參考文獻(xiàn)[12]方法測(cè)定其總黃酮含量為35.28%。

1.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞接種48h后，傾去培養(yǎng)基，分別加入含不同質(zhì)量濃度樣品培養(yǎng)基培養(yǎng)，第4天換含同樣樣品的培養(yǎng)基，8d后加入5mg/mL的MTT溶液，每孔10μL，37℃孵育4h后，加入DMSO，每孔150μL，混勻，使甲臢完全溶解，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A給藥組)。以相同條件、相同體積不含樣品的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照，測(cè)定其吸光度(A細(xì)胞對(duì)照組)，按公式(1)計(jì)算細(xì)胞抑制率，求出半數(shù)中毒劑量(TC50)。空白組為測(cè)定時(shí)平行操作的空白對(duì)照組，測(cè)定吸光度(A空白組)。

1.5 藥物活性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)設(shè)無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照組、不同質(zhì)量濃度藥物組及陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組。HepG 2.2.15細(xì)胞接種48h后，傾去培養(yǎng)基，各質(zhì)量濃度藥物組分別加入含瑣瑣葡萄總黃酮(100、50、25、12.5μg/mL)的培養(yǎng)基、各質(zhì)量濃度陽(yáng)性對(duì)照組分別加入含3-TC(100、10、1μg/mL)的培養(yǎng)基，每孔200μL，每個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)每板各設(shè)6個(gè)細(xì)胞對(duì)照孔加入同體積無(wú)藥物培養(yǎng)基作為細(xì)胞對(duì)照組，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4d換含同樣樣品的培養(yǎng)基，第8天分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，置－20℃保存?zhèn)溆?，待測(cè)HBsAg、HBeAg和HBV DNA。

1.6 HBsAg和HBeAg的檢測(cè)

采用ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的濃度，以P/N(即樣品的吸光度與空白對(duì)照吸光度的比值)表示。根據(jù)公式(2)計(jì)算各濃度藥物對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率，計(jì)算半數(shù)有效濃度IC50。

式中：A給藥組為不同質(zhì)量濃度的藥物實(shí)驗(yàn)組的吸光度；A空白組為試劑盒測(cè)定時(shí)不加酶結(jié)合底物而平行操作的空白對(duì)照組；A細(xì)胞對(duì)照組為不加藥物處理的細(xì)胞對(duì)照組。

結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)所得TC50計(jì)算各樣品的治療指數(shù)(TI)，綜合判斷藥物效果。TI= TC50/IC50，TI＞2為有效低毒；1＜TI≤2為低效有毒；TI≤1為受試物毒性大，不宜于用于抗HBV治療。

1.7 HBV DNA的測(cè)定

按照HBV DNA熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV DNA的拷貝數(shù)。根據(jù)公式(3)計(jì)算各受試物對(duì)HBV DNA的抑制率。

式中：C給藥組為不同質(zhì)量濃度的藥物實(shí)驗(yàn)組的HBV DNA拷貝數(shù)；C細(xì)胞對(duì)照組為不加藥物處理的細(xì)胞對(duì)照組的HBV DNA拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞的毒性作用

MTT法測(cè)定細(xì)胞抑制率，結(jié)果顯示瑣瑣葡萄總黃酮及3-TC對(duì)Hep G 2.2.15細(xì)胞的毒性較小，其TC50分別為284.91μg/mL 和244.77μg/mL(表1、2)。

表1 瑣瑣葡萄總黃酮體外抗HBV效果Table 1 Inhibition effects of total flavones from Vitis vinifer L. on HBV in vitro

表2 瑣瑣葡萄總黃酮的治療指數(shù)Table 2 Therapeutic indexes of total flavones from Vitis vinifer L. for HBsAg and HbeAg

2.2 瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HBsAg和HBeAg分泌的影響

在瑣瑣葡萄總黃酮和3-TC對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的IC50分別為327.56μg/mL和315.37μg/mL，其TI為0.87和0.78；對(duì)HBeAg的IC50分別為215.34μg/mL和9051.01μg/mL，其TI分別為1.32和0.03，提示在此實(shí)驗(yàn)條件下，瑣瑣葡萄總黃酮抑制HepG 2.2.15分泌HBsAg和HBeAg的效果均優(yōu)于3-TC(表1、2)。

2.3 瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HBV DNA的影響

瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用隨質(zhì)量濃度的增大而逐漸增強(qiáng)，而3-TC可顯著抑制HBV DNA的分泌，各質(zhì)量濃度組DNA拷貝數(shù)＜103，超出試劑盒檢測(cè)下限(表1)。

3 討 論

瑣瑣葡萄為葡萄科小無(wú)核紅葡萄品系藥食兼用植物，藥用果實(shí)，主產(chǎn)于我國(guó)新疆吐魯番、和田、鄯善等地[13]；在維吾爾醫(yī)臨床主要應(yīng)用于脾胃不和、頭暈腰酸、神志不安以及小兒麻疹和肝炎等病癥的治療[14-15]，為探討瑣瑣葡萄的抗病毒藥效，本研究應(yīng)用Hep G 2.2.15細(xì)胞株對(duì)瑣瑣葡萄總黃酮進(jìn)行了抗HBV活性篩選，結(jié)果顯示：瑣瑣葡萄總黃酮用藥8d后，對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg具有顯著抑制作用，半數(shù)有效劑量(IC50)HBsAg為327.56μg/mL、HBeAg為215.34μg/mL，治療指數(shù)(TI)分別為HBsAg 0.87、HBeAg 1.32，抑制效果均優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物拉米呋啶，且藥物細(xì)胞毒性較小，半數(shù)中毒劑量(TC50)為284.91μg/mL；而瑣瑣葡萄總黃酮對(duì)HBV DNA也表現(xiàn)出一定的抑制作用，在100μg/mL時(shí)抑制率達(dá)到47.63%。細(xì)胞培養(yǎng)具有易于控制實(shí)驗(yàn)條件和均衡性好的特點(diǎn)，但體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不能反映體內(nèi)所特有的免疫調(diào)節(jié)及代謝對(duì)藥物效果的影響。因此，本研究結(jié)果雖然顯示瑣瑣葡萄總黃酮在體外具有一定的抗HBV生物學(xué)活性，與維吾爾醫(yī)臨床應(yīng)用效果相一致，但進(jìn)一步證實(shí)其抗病毒作用還須結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，其作用機(jī)制也有待于深入研究。

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Inhibitory Effects of Total Flavones from Vitis vinifer L. on Hepatitis B Virus in vitro

LIU Tao1，MA Long1,*，ZHAO Jun2，LI Hai-bo3
(1. Department of Toxicology, College of Public Health, Xinjiang Medical University,830011, China；2. Institute of Materia Medica of Xinjiang,830004, China；3. Nantong Center for Disease Control and Prevention, Nantong 226006, China)

Objective: To investigate the inhibitory effects of total flavones from Vitis vinifer L. on hepatitis B virus (HBV)replication and their toxicity in cultured human hepatocellular liver carcinoma cell line HepG 2.2.15 transfected with HBV DNA.Methods: After 8 days of treatment with total flavones from Vitis vinifer L., the contents of HBsAg and HBeAg in the cell culture supernatant of HepG 2.2.15 were measured by ELISA to calculate the inhibitory rates against the secretion of HBsAg and HBeAg, the change in HBV DNA was monitored by real-time PCR, and cytotoxicity test was performed using MTT assay.Results: Addition of total flavones from Vitis vinifer L. in a dosage range of 12.5 to 100μg/mL could reduce the contents of HBsAg and HBeAg in the cell culture supernatant of HepG 2.2.15 to different extents. Little cytotoxic effect was observed with a median toxic concentration (TC50) of 284.91 μg/mL. The median effective doses (IC50) on HBsAg and HBeAg were 327.56 μg/mL and 215.34 μg/mL, and the therapeutic index for HBsAg and HbeAg were 0.87 and 1.32, respectively. Total flavones from Vitis vinifer L. at 100 μg/mL could inhibit HBV DNA by 47.63%. Conclusion: Total flavones from Vitis vinifer L. have inhibitory effects on HBV in vitro.

Vitis vinifer L；flavones；hepatitis B virus；cell culture

R965

A

1002-6630(2011)05-0270-03

2010-06-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30660157)

劉濤(1974—)，女，副教授，博士，主要從事新疆特色藥食兼用植物開發(fā)應(yīng)用基礎(chǔ)研究。E-mail：xjmult@sina.com

*通信作者：馬龍(1957—)，男，教授，碩士，主要從事新疆特色藥食兼用植物開發(fā)應(yīng)用基礎(chǔ)研究。E-mail：xjmult@163.com