天藍色素馬雷訥素(marennine)研究現(xiàn)狀

毛得獎，朱亞玲，邢新會*

(1.山東輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，山東 濟南 250353；2.山東輕工業(yè)學院化學工程學院，山東 濟南 250353；3.清華大學化工系生物化工研究所，北京 100084)

天藍色素馬雷訥素(marennine)研究現(xiàn)狀

毛得獎1，朱亞玲2，邢新會3,*

(1.山東輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，山東 濟南 250353；2.山東輕工業(yè)學院化學工程學院，山東 濟南 250353；3.清華大學化工系生物化工研究所，北京 100084)

馬雷訥素(marennine)是一種由牡蠣舟形藻產(chǎn)生的水溶性天藍色多酚類色素，它能夠使牡蠣的腮和唇瓣變綠從而提高其經(jīng)濟價值。對于馬雷訥素的研究涉及其理化性質(zhì)、化學結(jié)構(gòu)、生物學活性、分離純化及分析測定方法等方面。牡蠣舟形藻是硅藻門中唯一能夠產(chǎn)生馬雷訥素的海洋硅藻，光照、營養(yǎng)、溫度、藻類競爭、藻體與牡蠣之間的相互作用等條件影響馬雷訥素的產(chǎn)生和積累。利用各種型式的生物反應器在人工控制條件下培育牡蠣舟形藻獲取高產(chǎn)量的馬雷訥素也得到了研究和應用。

馬雷訥素；水溶性天藍色素；牡蠣舟形藻

食用色素在人民生活中應用廣泛，并且與人民健康關系密切。由于人們逐漸認識到人工合成色素對于人體健康可能存在各種副作用，消費者對新穎天然色素產(chǎn)品越來越重視，尤其是對具有耐久性和顯著功能的天然色素產(chǎn)品特別青睞，藍色素和植物紅色素就是當前非常受歡迎的熱門色素。

雖然微生物產(chǎn)生的天然色素有較多的顏色品系，但藍色和綠色色素卻非常稀有。馬雷訥素(marennine)是由一種海洋硅藻產(chǎn)生的多酚類水溶性天藍色色素，它能夠使牡蠣的腮和唇瓣變綠從而提高其經(jīng)濟價值。由于牡蠣在全世界很多國家都是最重要的海洋經(jīng)濟種類之一，牡蠣養(yǎng)殖的總產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量也均在所有養(yǎng)殖品種中位居首位[1]。在我國，貝類養(yǎng)殖占海水養(yǎng)殖的比重高達80%以上，其中牡蠣養(yǎng)殖又在貝類養(yǎng)殖業(yè)中占重要地位，因此馬雷訥素對于提高海洋養(yǎng)殖經(jīng)濟收入具有重要意義。雖然馬雷訥素是一種潛在的非常有價值的天然藍色素來源，但目前除法國外世界其他國家對該藍色素的研究并不多見，在我國至今也未見有相關研究報道。本文對該藍色素的研究狀況進行總結(jié)概述，以期能夠促進國內(nèi)牡蠣養(yǎng)殖增值及天然活性色素開發(fā)生產(chǎn)。

1 馬雷訥素(marennine)名稱的由來

法國牡蠣養(yǎng)殖世界聞名，養(yǎng)殖歷史悠久，養(yǎng)殖區(qū)域主要位于法國西部的大西洋海岸(即布列塔尼(Bretagne)、盧瓦爾(Pays de la loire)、普瓦圖-沙朗特(Poitou-Charentes)3個省區(qū)的大西洋沿岸為主產(chǎn)區(qū))。在養(yǎng)殖過程中牡蠣的腮會由于羽狀硅藻——牡蠣舟形藻(Haslea ostrearia (Gaillon/Bory)Simonsen)(圖 1)分泌的水溶性藍色素而變綠，這一自然現(xiàn)象從17世紀開始見于記載。Puységur在1880年首先報道了這種藻類的圖片，Ranson[2]在1927年繪制了該藻的藍色細胞以及同種但沒有特征性藍色的細胞，Neuville等[3]在1971年對來自于單一純培養(yǎng)物的該藻進行了描述。

圖1 牡蠣舟形藻細胞(來自：http://www.staff.uni-marburg.de/～wenderot/)Fig.1 Navicula cells of Haslea ostrearia

Lankester[4]在1886年首次建議將牡蠣舟形藻分泌的胞外水溶性藍色素稱為“marennine”，是由于產(chǎn)生該色素的牡蠣舟形藻通常見于法國大西洋海岸普瓦圖-沙朗特省的馬雷訥-奧萊龍(Marennes-Oléron)地區(qū)的濱海水域中的緣故。因至今沒有合適的中文名稱與“marennine”相對應，所以秉承定名者的命名初衷將其中文名稱譯為“馬雷訥素”。

2 馬雷訥素的物理化學特征

牡蠣舟形藻是唯一能產(chǎn)生馬雷訥素的海洋微藻[5]，其胞內(nèi)馬雷訥素可以外泌到其生活的海水或淡水中。

2.1 馬雷訥素的物理特性

馬雷訥素易溶于水，水溶液呈天藍色，遇有機溶劑易沉降析出。牡蠣舟形藻細胞內(nèi)的馬雷訥素(IMn)在波長623nm處具有最大吸收峰，在波長585nm處具有一個微小的肩峰。未純化的牡蠣舟形藻細胞外的馬雷訥素(EMn)水溶液(pH8.2)分別在波長466nm和663nm處具有吸收峰，其中在后一波長處的吸收強度高于前者[6]。純化的IMn和EMn在pH8的碳酸鈉緩沖液中最大吸收波長分別為247、672nm和247、322、677nm。IMn和EMn在pH3～10范圍內(nèi)不具兩性離子形態(tài)并且其陰離子形式在水溶液中看起來是穩(wěn)定的[7]。

2.2 馬雷訥素的化學特性

在不同學者的研究中對馬雷訥素的化學屬性存在著不同的認識。Bocat[8]認為馬雷訥素是一種明顯不同于藻青蛋白的有色蛋白，Ranson[2]認同這一觀點同時還認為有脂質(zhì)成分與色素相連，后又推測該色素的輔基可能是類胡蘿卜素[9]。Robert等[6]報道認為馬雷訥素與c-藻青蛋白非常相似。Bachrach[10]、Moreau[11]和 Genevès等[12]推斷馬雷訥素是葉綠素的一種降解產(chǎn)物，但Robert[13]、Tremblin等[14]卻發(fā)現(xiàn)葉綠素含量變化與馬雷訥素產(chǎn)生之間沒有相關性。Neuville等[15]依據(jù)脅迫和環(huán)境條件導致色素在細胞積累從而認為馬雷訥素與花青素有關。Hardouin等[16]認為馬雷訥素是幾種大分子的混合物。Pouvreau等[7]用最新方法提純了馬雷訥素，并對其進行了比較全面的生物物理和生物化學性質(zhì)研究，認為IMn和EMn在化學本質(zhì)上難以區(qū)分，但應該都屬于多酚化合物。從它們具有不同的光譜特征和分子質(zhì)量(IMn：(10751±1)D；EMn：(9893±1)D)這些特征上可以認為胞內(nèi)外的色素可能具有不同的分子結(jié)構(gòu)?？梢悦鞔_認為其不具有脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)，不是多肽，不是多糖甚至也未被糖基化?？赡苡珊?未與過渡態(tài)金屬相連)的多環(huán)碳化物組成，不屬于花青素配基前體家族。

在對馬雷訥素一個多世紀的研究中，雖然對其化學結(jié)構(gòu)的認識經(jīng)歷了一個逐步深入的過程，但直到目前仍然未能完全解析[17]。

3 馬雷訥素的分離純化及分析測定方法

3.1 胞內(nèi)外馬雷訥素的分離純化方法

胞內(nèi)馬雷訥素分離純化方法：藻體經(jīng)離心收集后除去葉綠素、類胡蘿卜素、脂質(zhì)、糖類及蛋白質(zhì)類，過DEAE Sepharose CL-6B強離子交換柱進行濃縮，最后進行透析脫鹽和冷凍干燥[18]。較為簡化的提取方法為：離心收集藍色藻體，液氮研磨，NH4HCO3緩沖液(pH8)提取至無色，藍色提取液經(jīng)過濾得到胞內(nèi)馬雷訥素粗提物[19]。

胞外馬雷訥素分離純化方法：胞外馬雷訥素的分離濃縮相對較為簡單。采用納濾膜處理進行脫鹽和色素濃縮[20]或先行采用微孔濾膜過濾收集濾液，繼而采用超濾、半制備性陰離子交換層析(瓊脂糖凝膠過濾高效液相層析光電二極管陣列檢測、陰離子交換高效液相層析光電二極管陣列檢測、反相(C18柱)高效液相層析光電二極管陣列檢測)、透析脫鹽和冷凍干燥等步驟得到胞外馬雷訥素精制品[19-21]。

3.2 胞內(nèi)外馬雷訥素的定量測定方法

牡蠣舟形藻產(chǎn)生的馬雷訥素首先在細胞的兩端積累[22]，然后向胞外分泌，因此總的馬雷訥素是由胞內(nèi)和胞外兩部分組成的。由于胞內(nèi)馬雷訥素的低有機溶性以致將其提取出來進行測定有相當難度，所以早期多不提取而直接測定，分析方法有：1)生物計量分析法。利用顯微鏡和測微計將含色素藻細胞的頂端藍色區(qū)域的長度與整個細胞和葉綠體進行對比而加以分析[23]；2)圖像分析法。利用連接有圖像分析軟件的彩色CD照像機分析細胞內(nèi)的色素含量[22,24]；3)細胞分光光度法。采用微區(qū)計數(shù)的方法利用細胞顯微分光光度計測定吸光度進行含量測定[6]。這些方法其實更象是馬雷訥素產(chǎn)量的定性估計方法而不是真正的定量方法。

基于對馬雷訥素物理特性的了解，現(xiàn)在主要采用光譜分析法進行定性和定量測定。利用葡聚糖凝膠過濾處理樣品后進行高效液相色譜分析，測定波長674nm處的洗脫峰面積，將其與同樣條件下的馬雷訥素外標標準品的洗脫峰面積進行對比，從而進行定量測定。該方法在定量的同時通過運用光電二極管陣列檢測也可以實現(xiàn)對樣品純度及分子完整性的分析[21]。

4 馬雷訥素的生物活性及應用

4.1 化感相克活性

馬雷訥素除對硅藻的生長具有劑量依賴的遮光抑制效應之外，還具有化學抑制作用，即化感相克活性。Skeletonema costatum、Nitzschia closterium、Haslea curcigera 3種硅藻對于馬雷訥素的化學抑制效應比較敏感，Entomoneis pseudoduplex硅藻則只受馬雷訥素的遮光抑制而對其化學抑制作用不敏感。Pouvreau等[25]據(jù)此認為馬雷訥素的生態(tài)生理功能是在一個池塘整體水平上充當化感相克物質(zhì)，以維持牡蠣舟形藻能夠在種間競爭中獨自旺盛生長。

4.2 光保護活性

實驗證明馬雷訥素并不參與光合作用而更可能是具有光保護活性。因為馬雷訥素能夠遮蔽紅光，而光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)和光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的光捕獲單元——類胡蘿卜素復合物卻需要捕獲紅光從而儲存光能，所以馬雷訥素并不參與光捕獲過程。但它能夠保護硅藻在強光下的光合作用系統(tǒng)，從而保護硅藻免于遭受強光照射損傷[17,19,24,26-27]。

4.3 抗病毒活性

牡蠣舟形藻的水提物在體內(nèi)和體外均具有拮抗人類肺癌細胞及抗艾滋病病毒活性[28]，雖然研究者認為這些活性多是由一些二倍半萜或舟形藻不飽和多烯提供的，但是也沒有明確排除馬雷訥素的作用[29]。牡蠣舟形藻的水提物具有抗人類實體瘤細胞(如肺癌NSCLC-N6細胞、腎癌E39細胞、惡性黑素瘤M96細胞)增殖性能。這些癌變細胞尤其對化療有抵抗力，而藻水提物能夠體外抑制這三個細胞系的生長并能夠?qū)SCLC-N6細胞抑止在細胞周期的G1/S期。除此之外，藻水提物能夠強烈抑制祼鼠體內(nèi)NSCLC-N6細胞瘤的生長。

4.4 抗氧化活性及清除自由基活性

馬雷訥素要比通常使用的天然及合成食品抗氧化劑具有更高的抗氧化活性，也能夠有效地清除DPPH自由基(二苯代苦味酰肼自由基)，O2－·(超氧陰離子自由基)，·OH(羥自由基)等自由基[17]。

由于馬雷訥素具有以上所述多種生物活性，使其在最先被應用于牡蠣養(yǎng)殖之外，也被應用于食品著色，化妝品、藥品及個人護理產(chǎn)品等行業(yè)[26-27]。

5 馬雷訥素產(chǎn)生藻——牡蠣舟形藻的相關研究

5.1 光對馬雷訥素合成的影響

牡蠣舟形藻是硅藻門中唯一能夠產(chǎn)生馬雷訥素的海洋硅藻，色素的產(chǎn)生與積累受光照強度及光質(zhì)、光暗周期的影響。增強光照強度能夠?qū)е聦?shù)生長期的牡蠣舟形藻葉綠體長度減小，但對胞內(nèi)馬雷訥素積累區(qū)的大小卻沒有明顯影響。雖然較強光照確實能夠使對數(shù)生長期的牡蠣舟形藻細胞發(fā)生藍變[30]，但是牡蠣舟形藻細胞藍變也可以在低光照下發(fā)生[31]。與白光對照相比，牡蠣舟形藻在藍色光低光照強度而不是高光照強度下生長更快。在藍光下對數(shù)生長后期的牡蠣舟形藻細胞中馬雷訥素的產(chǎn)量是最高的，而且不管光馴化階段采用何種顏色的光進行處理，馬雷訥素的含量在細胞生長過程中也是增加的[32]。

5.2 馬雷訥素合成與牡蠣舟形藻碳固定的關系

在牡蠣舟形藻的批式培養(yǎng)中碳固定速度最高時細胞體內(nèi)并不積累馬雷訥素，隨著該色素的積累碳固定速率逐漸下降。在體外，檢測不到涉及碳固定過程的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的活性，而能夠檢測到1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPC)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)的酶活性而且兩種酶的活性相近。馬雷訥素提取物在體外能夠強烈抑制羧化酶的活性[14]。牡蠣舟形藻細胞周質(zhì)中的碳酸酐酶(CA)活性在低光照條件下要比高光照條件下高，但細胞內(nèi)碳酸酐酶(CA)活性卻保持不變[30]。

5.3 牡蠣舟形藻的富集培養(yǎng)技術

產(chǎn)生并積累和外泌馬雷訥素的牡蠣舟形藻在自然環(huán)境中存在春季和秋季兩個數(shù)量增殖高峰期，但主要發(fā)生在牡蠣傳統(tǒng)育肥的秋季(八月末到十二月)。由于自然條件下牡蠣舟形藻群體數(shù)量的消長存在諸多不可控因素，因而目前人們嘗試采用人工方法培養(yǎng)富集牡蠣舟形藻并希望獲得高濃度的馬雷訥素。在10m3的池塘中進行戶外培育，8d后牡蠣舟形藻發(fā)展成為硅藻中的優(yōu)勢藻(占66%)，平均細胞濃度為2×105個/mL，馬雷訥素質(zhì)量濃度3.4mg/L，但池塘海水入口處過濾系統(tǒng)的過濾效能亟待改善[33]。

利用瓊脂包埋牡蠣舟形藻可以提高馬雷訥素的產(chǎn)率。包埋后回收色素濃度依據(jù)包被瓊脂中的初始藻細胞量在34～92mg/L(液體培養(yǎng)基)之間變動，相當于15～50mg/(d·L)瓊脂膠。這樣的固定化細胞體系能夠重復運行3次(工作時間＞1000h)而沒有顯著的產(chǎn)率降低[34]。為進一步提高效能，中小型生物反應器也可以用于藻體的富集及獲取更大量的馬雷訥素。Rossignol等[35]比較了兩種不同設計的反應器，第一種為細胞不固定并可在反應器內(nèi)循環(huán)，外部回路配有超濾膜裝置的反應器形式；第二種為細胞包被在管狀瓊脂膠層中的光照反應器形式。研究認為兩種反應器都可以運行長達40d的時間而沒有任何外來污染，且都可以達到每天5～7mg/10億個細胞的馬雷訥素產(chǎn)率。從馬雷訥素濃度和單位體積培養(yǎng)液的色素產(chǎn)率來看，非固定細胞膜生物反應器系統(tǒng)的胞外馬雷訥素產(chǎn)量更大一些。但以單位細胞計，還是固定化細胞光照生物反應器的胞外馬雷訥素產(chǎn)率更高一些。

在這兩種反應器的基礎上Rossignol等[36]設計了一種新型的具浸沒式超濾膜的光照生物反應器，使得能耗降到最低，藻細胞也不再經(jīng)受泵送或循環(huán)過程中產(chǎn)生的剪切脅迫。在該反應器中藻體生物量及馬雷訥素產(chǎn)量在3周內(nèi)保持穩(wěn)定，馬雷訥素產(chǎn)率達到每天30～35mg/10億個細胞，濃度約為常規(guī)批式光照生物反應器的3倍多。

5.4 異宗配合生殖現(xiàn)象

牡蠣舟形藻不僅可以以同宗配合方式進行生殖，也可以以異宗配合方式進行生殖，異宗配合生殖方式并不是牡蠣舟形藻的專性育種機制。而且在牡蠣舟形藻種內(nèi)單一群落內(nèi)的有性生殖模式在形態(tài)上是同配生殖的，這與不同的單一群落之間的生殖模式?jīng)]有什么不同。對于牡蠣舟形藻繁殖機制的了解可以使人們能夠“按需”培育具有新性狀的克隆以便滿足生產(chǎn)生物質(zhì)、色素或活性復合物等產(chǎn)業(yè)化開發(fā)需求[5]。

6 展 望

可能由于特殊的自然環(huán)境條件限制，馬雷訥素最常見于法國海岸的牡蠣養(yǎng)殖業(yè)，卻在世界范圍內(nèi)沒有引起廣泛關注，但由于馬雷訥素具有獨特的藍色及多種生物活性而作為一種新興熱門天然色素受到了世界著名色素生產(chǎn)商的重視，因此積極進行相關研究，這將對開發(fā)新的天然色素來源具有重要意義。

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Research Progress of Azure Pigment Marennine

MAO De-jiang1，ZHU Ya-ling2，XING Xin-hui3,*
(1. School of Food and Bioengineering, Shandong Polytechnic University, Jinan 250353, China；2. School of Chemical Engineering,Shandong Polytechnic University, Jinan 250353, China；3. Institute of Biochemical Engineering, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

Marennine, a kind of water-soluble azure polyphenol pigment produced by marine diatom—Haslea ostrearia, can enhance the green color ofgills and labial palps and increase the economic value. Studies on marennine involved in its physicochemical properties, chemical structure, biological activity, purification and determination methods are discussed in this paper. Haslea ostrearia is the only marennine-producing marine diatom from Bacillariophyta. Moreover, the productivity and accumulation of marennine are affected by irradiation, nutrients, temperature, algal competition, interaction between algae and oysters. Bioreactors are also used to cultivate Haslea ostrearia under the controlled conditions for achieving high yield of marennine.

marennine；water-soluble azure pigment；Haslea ostrearia (Gaillon/Bory) Simonsen

TS202.3

A

1002-6630(2011)05-0321-05

2010-06-28

毛得獎(1971—)，男，副教授，博士，主要從事天然色素及工業(yè)微生物應用研究。E-mail：maodej@126.com

*通信作者：邢新會(1963—)，男，教授，博士，主要從事生物化工及環(huán)境生物工程研究。E-mail：xhxing@tsinghua.edu.cn