姚 南，王 衛(wèi)，叢 喆，陳 霆，金 光，陶 真，陳志偉，魏 強(qiáng)

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.香港大學(xué)李嘉誠(chéng)醫(yī)學(xué)院艾滋病研究所，香港 999077)

RT-SHIV感染中國(guó)恒河猴及體內(nèi)傳代

姚 南1，王 衛(wèi)1，叢 喆1，陳 霆1，金 光1，陶 真1，陳志偉2，魏 強(qiáng)1

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.香港大學(xué)李嘉誠(chéng)醫(yī)學(xué)院艾滋病研究所，香港 999077)

目的 了解RT-SHIV感染中國(guó)恒河猴的感染特點(diǎn)，研究 RT-SHIV在中國(guó)恒河猴中傳代特點(diǎn);建立RT-SHIV中國(guó)恒河猴動(dòng)物模型，為評(píng)價(jià)HIV-1藥物有效性提供動(dòng)物平臺(tái)。方法 選擇4只健康恒河猴，其中兩只動(dòng)物經(jīng)上肢靜脈感染RT-SHIV病毒，感染急性期采取外周血分離CD8-PBMC，擴(kuò)增病毒，將新制備的病毒靜脈感染另外兩只中國(guó)恒河猴，通過(guò)監(jiān)測(cè)血漿病毒載量，CD4+/CD8+比值，CD4+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)，了解實(shí)驗(yàn)猴的感染狀態(tài)，同時(shí)分析病毒RT基因變異情況。結(jié)果 4只動(dòng)物均獲得系統(tǒng)性感染，且傳代動(dòng)物急性期表現(xiàn)更為強(qiáng)烈，RT基因在感染和傳代的過(guò)程中共觀察到3個(gè)氨基酸的改變。結(jié)論 本研究為RT-SHIV中國(guó)恒河猴模型的建立提供了基礎(chǔ)信息。

RT-SHIV;傳代;RT基因突變

從1981年以來(lái)，艾滋病毒已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近三十年，人類(lèi)至今仍未研發(fā)出有效的艾滋病疫苗，因此抗艾滋病的藥物治療成為重要的防治手段。艾滋病的治療藥物主要為逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，其針對(duì)HIV-1的主要基因?yàn)镽T基因和蛋白酶基因。RT-SHIV病毒為替換進(jìn)HIV-1 RT基因的嵌合病毒［1］，其對(duì)以 HIV-1 RT基因?yàn)榘悬c(diǎn)設(shè)計(jì)的藥物具有很高的敏感性，由其建立的動(dòng)物模型能夠?qū)δ孓D(zhuǎn)錄酶抑制劑進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)［2］，同時(shí)可研究藥物壓力下的基因耐藥性突變問(wèn)題。本研究擬通過(guò)RT-SHIV感染中國(guó)恒河猴，并在猴體傳代增強(qiáng)RT-SHIV感染中國(guó)恒河猴的能力，從而為建立一個(gè)合格的藥效學(xué)評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型提供毒株和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康中國(guó)恒河猴4只，購(gòu)自北京協(xié)爾鑫公司［SCXK(京)2005-2005］，體重3 kg左右。編號(hào)分別為 G1101V、G1102V、G1103V、G1104V。經(jīng)間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)排除相關(guān)慢病毒(SIV、SRV-1、STLV-1)感染。動(dòng)物飼養(yǎng)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

1.2 RT-SHIV毒株

RT-SHIV由NIH AIDS Research and Reference Reagent Program(Dr.Thomas North and Dr.Joseph Sodroski) 提供［1，3，4］。

1.3 樣品采集

分別于 0、3、7、10、14、21、28、35、42、49、56、66 d用鹽酸氯胺酮對(duì)中國(guó)恒河猴進(jìn)行麻醉，采集EDTA抗凝血3 mL。

1.4 RT-SHIV感染恒河猴外周血病毒載量的檢測(cè)

Trizol法提取血漿中病毒RNA，Quantitect SYBR Green RT-PCR Kit(Qiagen，204243) Roche LightCycler熒光定量?jī)x測(cè)定血漿病毒RNA載量，該方法靈敏性為 103copies/mL［5］。

1.5 RT-SHIV感染恒河猴CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)和B淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)檢測(cè)

根據(jù)流式細(xì)胞儀測(cè)定的 CD4+/CD8+比值，CD20比值，并根據(jù)血常規(guī)結(jié)果計(jì)算出CD4+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)。所使用的抗體為PerCP-CD3(BD，552851)、FITC-CD4(BD，556615)、PE-CD8(BD，557086)、 APC-CD20(BioLegend，302310)，使用BD FACS Calibur進(jìn)行分析。

1.6 RT-SHIV感染恒河猴全基因組中RT基因擴(kuò)增和測(cè)序

用 QIAamp DNA Blood Minikit(Qiagen，51106)提取外周血基因組DNA。巢式PCR擴(kuò)增全基因組中RT基因，引物分別為RT out：CAGAGGATTTGCTGCACCTCAATTC，Anti-RTout： CAATCCATTTGCCAAGTCCCTAGAT;RT：ATTAGCCCTATTGAGACTGTACCA，Anti-RT： AGCACTGACTAATTTATCTACTTG。外套擴(kuò)增程序?yàn)?94℃ 5 min;94℃ 1 min，50℃30 s，68℃ 2 min;68℃ 10 min，30 個(gè)循環(huán);內(nèi)套擴(kuò)增程序?yàn)?94℃ 5 min;94℃ 1 min，45℃ 30 s，68℃2 min;68℃ 10 min，25個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 RT-SHIV感染中國(guó)恒河猴載量結(jié)果

第一代感染恒河猴G1101V和G1102V分別于10 d、14 d檢測(cè)到病毒載量，最高峰值分別為6.9×105copies/mL和 2.1 ×106copies/mL，于 35 d、42 d檢測(cè)不出載量。二次傳代恒河猴G1103V和G1104V在4 d便檢測(cè)到病毒載量，最高峰值分別為2.5×104copies/mL和5.4×106copies/mL，G1103V于42 d檢測(cè)不出載量，G1104V在70 d仍然在檢測(cè)靈敏線(xiàn)以上(圖1)。

2.2 RT-SHIV感染中國(guó)恒河猴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)結(jié)果

兩只第一代感染中國(guó)恒河猴表現(xiàn)為，G1101V的CD4+/CD8+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)比值由0 d基本值1.83持續(xù)波動(dòng)上升;CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)在0 d基本值1973個(gè)/μL左右波動(dòng)，最低值出現(xiàn)在 50 d，為1598個(gè)/μL;B淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)由感染后 3 d的5848個(gè)/μL持續(xù)下降到 66 d的 3099 個(gè)/μL，下降了近1/2。G1102V的CD4+/CD8+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)比值在0d基本值2.07上下波動(dòng)，CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的0 d基本值為1918個(gè)/μL，在第7天和50 d出現(xiàn)了兩個(gè)低值分別為1083個(gè)/μL和929個(gè)/μL;B淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)由感染后3 d的2371個(gè)/μL持續(xù)下降至21 d的最低值1286個(gè)/μL，繼而在1600個(gè)/μL左右徘徊。

圖1 RT-SHIV感染恒河猴血漿病毒載量檢測(cè)圖Fig.1 Measurement of viral loads following RT-SHIV infection

圖2 RT-SHIV感染恒河猴的 CD4+/CD8+比值，CD4+T淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞絕對(duì)數(shù)監(jiān)測(cè)圖Fig.2 Measurement of CD4+/CD8+ratio，CD4+T-cell and total CD20+B-cell numbers following RT-SHIV infection

二次傳代中國(guó)恒河猴猴表現(xiàn)為，G1103V的CD4+/CD8+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)比值由0 d基本值1.34下降到11 d的最低值0.69，11 d和14 d出現(xiàn)倒置。18 d恢復(fù)到初始水平，后面的時(shí)間點(diǎn)在該水平上徘徊;CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)由0 d 889個(gè)/μL降到21 d最低值533個(gè)/μL，然后反彈上升;B淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)由4 d的1 348個(gè)/uL降到7 d的547個(gè)/μL，然后 14 d反彈回 1200個(gè)/μL，在此基礎(chǔ)上徘徊。G1104V CD4+/CD8+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)比值由0 d基本值1.15下降到14 d的最低值0.62，后期一直在1左右波動(dòng);CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)在急性期出現(xiàn)了一個(gè)下降趨勢(shì)由453個(gè)/uL降到349個(gè)/μL，然后一直在450個(gè)/μL左右徘徊;B淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)由4 d的1 164個(gè)/μL，在第7天下降到698個(gè)/μL，然后在14d反彈回1100個(gè)/μL，以后并在1100個(gè)/μL的水平上波動(dòng)(圖2)。

2.3 RT-SHIV感染中國(guó)恒河猴后的RT基因突變情況

RT基因和RNAse H基因全長(zhǎng)氨基酸數(shù)為560個(gè)，比對(duì)的序列為RT基因的26-525個(gè)氨基酸，堿基序列為76-1575位堿基。在堿基序列比對(duì)方面，303位的G-A，1 188位的C-T突變所有樣本都存在，535位的G-A，558位的 G-A存在于除1-21(表示的為G1101V第21天的樣本，以下類(lèi)推)外的所有序列，569位的C-T存在于除1-21和2-28的所有序列，1 281位的A-T僅存在于2-28中。其中有義突變?yōu)?58位，569位和1281位，氨基酸分別產(chǎn)生了 E(谷氨酸)-K(賴(lài)氨酸)，T(蘇氨酸)-I(異亮氨酸)，L(亮氨酸)-F(苯丙氨酸)的突變(圖3)。

圖3 RT基因氨基酸序列比對(duì)圖Fig.3 RT amino acid sequence alignment

3 討論

RT-SHIV中國(guó)恒河猴動(dòng)物模型是為篩選逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，并對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)藥效學(xué)評(píng)價(jià)提供的一個(gè)動(dòng)物平臺(tái)，同時(shí)還可用于研究逆轉(zhuǎn)錄酶基因的一系列耐藥性突變問(wèn)題。該模型的建立首先RT-SHIV需要能夠感染中國(guó)恒河猴，RT-SHIV病毒感染中國(guó)恒河猴這一指標(biāo)我們已經(jīng)完成，以200 TCID50感染，在第10天檢測(cè)到病毒載量，且最高峰值達(dá)2×106copies/mL。然而在第42天，病毒載量由陽(yáng)轉(zhuǎn)陰，即低于1 000 copies/mL，這為我們接下來(lái)的給藥提供了難題，現(xiàn)已檢測(cè)不出病毒載量，便不知藥物的效果如何。因而我們期待能有一種毒力更強(qiáng)的RTSHIV感染中國(guó)恒河猴。

SHIV病毒的猴體內(nèi)傳代是增強(qiáng)SHIV病毒毒力的一種常用方法，其主要原理是原始 SHIV病毒株在感染恒河猴后，免疫系統(tǒng)對(duì)該種 SHIV產(chǎn)生一系列的免疫反應(yīng)以清除病毒，與此同時(shí)，SHIV病毒自身會(huì)產(chǎn)生一些突變，以逃逸這種免疫壓力。在經(jīng)過(guò)這一系列的突變后SHIV病毒能夠更好的感染同一物種。本實(shí)驗(yàn)使用的傳代方式為急性期采取外周血體外擴(kuò)增病毒，不同于使用感染猴全血直接傳代，該種傳代方法的好處是可以濃縮病毒，使其更好的發(fā)揮功用。但是這種方式非常復(fù)雜，且在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中易發(fā)生突變。我們通過(guò)猴體傳代來(lái)增強(qiáng)RT-SHIV病毒毒力，期望RT-SHIV病毒能在中國(guó)恒河猴體內(nèi)長(zhǎng)期維持一種高載量，為我們接下來(lái)的藥效學(xué)評(píng)價(jià)研究提供基礎(chǔ)。在對(duì)傳代猴和原始感染猴檢測(cè)指標(biāo)的對(duì)比中我們發(fā)現(xiàn)，傳代猴的RNA病毒載量出現(xiàn)的時(shí)間更早，維持的時(shí)間更長(zhǎng)能維持到70 d。且載量最高值也由原來(lái)的2×106copies/mL提高到6×106copies/mL。對(duì) CD4+/CD8+比值的觀察中我們可以看到，傳代猴急性期出現(xiàn)了明顯的倒置現(xiàn)象，而原始感染猴不是很明顯。CD4+T淋巴細(xì)胞的減少趨勢(shì)也更為明顯。這些現(xiàn)象說(shuō)明RTSHIV病毒經(jīng)過(guò)在體內(nèi)的一次傳代后已經(jīng)具有適應(yīng)中國(guó)恒河猴的體內(nèi)環(huán)境的趨勢(shì)。

對(duì)RT-SHIV病毒B淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的監(jiān)測(cè)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，初始感染 RT-SHIV的恒河猴(G1101V，G1102V)的B淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯持續(xù)下降的趨勢(shì)，這不同于文獻(xiàn)報(bào)道SHIV/SIV病毒的B淋巴細(xì)胞在急性期下降，后期有反彈恢復(fù)的特征［6］。傳代恒河猴的 B淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)在急性期出現(xiàn)一個(gè)暫時(shí)的急劇性下降后于14 d又反彈回原來(lái)的基礎(chǔ)值，并未表現(xiàn)出和初始感染猴一樣持續(xù)下降的趨勢(shì)。在研究B淋巴細(xì)胞的過(guò)程中我們?cè)O(shè)置了一個(gè)用SHIV-1157ipd3N4感染的對(duì)照猴，同時(shí)監(jiān)測(cè)他的B淋巴細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其在感染急性期呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，但是過(guò)完急性期后絕對(duì)數(shù)值又反彈回原來(lái)的數(shù)量(數(shù)據(jù)未提供)。文獻(xiàn)報(bào)道稱(chēng)RT-SHIV感染的恒河猴會(huì)表現(xiàn)出B淋巴細(xì)胞的持續(xù)下降趨勢(shì)，這是其主要特征之一［7］，這一趨勢(shì)在我們的初始感染恒河猴中表現(xiàn)明顯，而在傳代猴中這一趨勢(shì)發(fā)生了改變，表現(xiàn)出和SHIV-1157ipd3N4感染恒河猴相同的趨勢(shì)，導(dǎo)致這一趨勢(shì)改變的原因是什么，是否是病毒基因在傳代過(guò)程中發(fā)生的改變而導(dǎo)致的，這些問(wèn)題有待我們進(jìn)行更為深入的研究去解決。

逆轉(zhuǎn)錄酶相關(guān)的基因?yàn)镽T基因和RNAse H基因，這兩個(gè)基因由1 680個(gè)堿基決定，共編碼560個(gè)氨基酸。在研究RT基因的突變過(guò)程中，由于PCR和測(cè)序等客觀因素，我們只截取了存在高可信度的500個(gè)氨基酸進(jìn)行分析研究。發(fā)現(xiàn)在病毒的感染階段RT基因發(fā)生突變的幾率較小，第一代感染猴G1101V和G1102V在500個(gè)氨基酸中僅出現(xiàn)了2個(gè)氨基酸突變，在二次傳代猴 G1103V和 G1104V中也僅出現(xiàn)2個(gè)氨基酸突變，且該突變對(duì)整個(gè)病毒的感染并無(wú)太大的影響，表明RT-SHIV的RT基因在感染和傳代過(guò)程中保持相對(duì)穩(wěn)定，這對(duì)于今后的藥物評(píng)價(jià)和耐藥性突變研究提供了基礎(chǔ)條件。

［1］ Uberla K，Stahl-Hennig C，Bottiger D，et al.Animal model for the therapy of acquired immunodeficiency syndrome with reverse transcriptase inhibitors［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92(18)：8210-8214.

［2］ Jiang Y，Tian B，Saifuddin M，et al.RT-SHIV，an infectious CCR5-tropic chimeric virus suitable for evaluating HIV reverse transcriptase inhibitors in macaque models［J］.AIDS Res Ther，2009，6：23.

［3］ Soderberg K，Denekamp L，Nikiforow S，et al.A nucleotide substitution in the tRNA(Lys)primer binding site dramatically increases replication of recombinant simian immunodeficiency virus containing a human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase［J］.J Virol，2002，76(11)：5803-5806.

［4］ North TW，Van Rompay KK，Higgins J，et al.Suppression of virus load byhighlyactive antiretroviraltherapy in rhesus macaques infected with a recombinant simian immunodeficiency virus containing reverse transcriptase from human immunodeficiency virus type 1［J］.J Virol，2005，79(12)：7349-7354.

［5］ 叢喆，李兆忠，魏強(qiáng)，等.SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量 RTPCR測(cè)定猴免疫缺陷病毒 RNA拷貝數(shù)方法的建立［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2006，14(004)：271-275.

［6］ Kuhrt D，F(xiàn)aith SA，Leone A，et al.Evidence of early B-cell dysregulation in simian immunodeficiency virus infection：rapid depletion of naive and memory B-cell subsets with delayed reconstitution of the naive B-cell population［J］.J Virol，84(5)：2466-2476.

［7 ］ Hofman MJ，Higgins J，Matthews TB，et al.Efavirenz therapy in rhesus macaques infected with a chimera of simian immunodeficiency viruscontaining reverse transcriptase from human immunodeficiency virus type 1［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48(9)：3483-3490.

RT-SHIV Infected and Passaged in Chinese-Origin Rhesus Monkeys

YAO Nan1，WANG Wei1，CONG Zhe1，CHEN Ting1，JIN Guang1，TAO Zhen1，CHEN Zhi-wei2，WEI Qiang1
(1.Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Disease Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China;2.AIDS Institute，Li Ka Shing Faculty of Medicine，The University of Hong Kong，Hong Kong 999077，China)

Objective To study the characteristics of RT-SHIV passaging in Chinese rhesus macaques and to establish a RT-SHIV/rhesus animal model providing an animal platform in evaluation of the effectiveness of HIV-1 drugs.Methods Four healthy rhesus macaques selected were negative to SIV，SRV and STLV-1.Two monkeys of them were infected with RT-SHIV intravenously.Blood samples were collected from the infected monkeys at the acute phase and CD8-PBMC were isolated，and then propagated RT-SHIV.The propagated RT-SHIV with PBMC were injected intravenously into the other two monkeys.Viral load in plasma，CD4+/CD8 ratio and absolute number of CD4+ T lymphocytes and B lymphocytes were detected，and the RT gene variation was analyzed.Results Systemic infection was established in all of the four rhesus macaques，and the two passaged animals demonstrated more severe changes at the acute phase.There were three amino acid changed during infection and passages.Conclusion The results of our study provide basic information for the establishment of RT-SHIV/Chinese-origin rhesus monkeys models.

RT-SHIV;Passage;RT gene mutation

R33

A

1671-7856(2011)04-0016-05

2010-09-29

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.004

“十一五”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)課題 (2009ZX10004-307);協(xié)和青年基金(RT-SHIV動(dòng)物模型的建立)。

姚南，男，碩士研究生，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)研究工作。

魏強(qiáng)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)。E-mail：weiqiang0430@sohu.com。