奶山羊乳腺組織中基因CCDC85B的克隆

趙婧，閆宏博，孫瑞秋，李慶章，高學(xué)軍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

奶山羊乳腺組織中基因CCDC85B的克隆

趙婧，閆宏博，孫瑞秋，李慶章，高學(xué)軍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

克隆奶山羊乳腺中基因CCDC85B。從本實(shí)驗(yàn)室前期建立的基因文庫(kù)中挑選出CCDC85B的17 bp標(biāo)簽，采用GLGI和RACE技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得基因的全長(zhǎng)。結(jié)果表明，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 282 bp序列，其中編碼區(qū)為606 bp，編碼202個(gè)氨基酸殘基，BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，該序列與已知牛、人CCDC85B的同源性分別為100%和83%，證明此基因確為奶山羊乳腺組織中的CCDC85B，為該基因的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析和功能研究奠定基礎(chǔ)。

奶山羊；乳腺；CCDC85B；GLGI；RACE

0 引言

cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈。然后用PCR擴(kuò)增出從某個(gè)特定位點(diǎn)到3’端或5’端之間的未知核苷酸序列，該方法也被稱為錨定PCR（anchored PCR)[1]或單邊PCR（one-side PCR)[2]。如要研究同一基因家族的不同成員，可設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物[3-8]。

GLGI技術(shù)是將包括17bp的LongSAGE標(biāo)簽和單一堿基dA、dC或dG與oligo-dT結(jié)合的錨定引物進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，最終得到的是含有SAGE標(biāo)簽的長(zhǎng)片段DNA擴(kuò)增產(chǎn)物[9,10]。

CCDC85B基因是一個(gè)含有85B的螺旋結(jié)構(gòu)域，參考國(guó)內(nèi)外資料，其可能對(duì)脂細(xì)胞分化有影響，負(fù)向調(diào)節(jié)有絲分裂的克隆擴(kuò)增，但具體在動(dòng)物乳腺中的研究尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合了RACE和GLGI兩種技術(shù)，成功地克隆出CCDC85B在奶山羊乳腺中的全長(zhǎng)序列，為深入地進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析和研究該基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料

健康關(guān)中奶山羊泌乳期乳腺組織（本實(shí)驗(yàn)室凍存的組織樣）；克隆載體pMD18-T，dNTP，各種DNA Marker，限制性內(nèi)切酶SalⅠ，HindⅢ，KpnⅠ和LATaq DNA聚合酶（均購(gòu)自大連蓮寶生物公司）；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒（均購(gòu)自AXYGEN公司）；Trizol（購(gòu)自Invitrogene公司）；SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（購(gòu)自Invitrogene公司）。

2 方法

從奶山羊乳腺組織中用Trizol法提取RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃中保存。

2.1 SAGE-tag和GLGI分析

通用引物UPM為SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech）中提供；特異性引物GSP1為本實(shí)驗(yàn)室前期建立的Long-SAGE基因庫(kù)中獲取的CCDC85B標(biāo)簽前面加上CATG作為粘性末端。

引物序列如下：

UPM：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'

GSP1：5'-CATGCAGGAGGTGAATCGGCA-3'

經(jīng)過一次PCR擴(kuò)增，將目的條帶純化，再與T載體連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選并鑒定陽(yáng)性重組子后，測(cè)序。

2.2 5'RACE

重新設(shè)計(jì)并合成引物，序列如下：

GSP2：5'-CTGTGCCCTCAATCATCTGGGGA-3'

UPM:5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'

經(jīng)PCR擴(kuò)增后，步驟同1.2.1。

2.3 序列的拼接及基因全長(zhǎng)的獲得

將2.1以及2.2 PCR擴(kuò)增的結(jié)果進(jìn)行拼接，從而獲得全長(zhǎng)序列。利用3’和5’末端信息設(shè)計(jì)引物，以5’-RACE-ready cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，通過長(zhǎng)距離（LD）PCR獲得全長(zhǎng)序列。

3 結(jié)果與分析

3.1 總RNA的含量和純度鑒定

3.1.1 總RNA含量和純度的紫外分光測(cè)定

提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)得的OD260/OD280分別為1.93，OD260/OD280比值在1.8～2.0范圍內(nèi)，表明無蛋白質(zhì)、基因組DNA污染。

3.1.2 總RNA1.8%瓊脂糖凝膠電泳分析

總RNA經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳后可見兩條主帶28S和18S，且兩條主帶的亮度28S︰18S約為2︰1，隱約可見溴酚藍(lán)前面有一條很淺的條帶5S,說明提取的總RNA完整，未出現(xiàn)降解，可進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

3.2 GLGI的結(jié)果

見有350 bp左右的條帶（圖1），膠回收后與pMD-T載體連接過夜，再連接感受態(tài)細(xì)胞后，進(jìn)行陽(yáng)性重組子的篩選，挑取單菌落搖菌6～8 h后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒驗(yàn)證結(jié)果見條帶與PCR膠回收條帶大小一致（圖2）。

圖1 GLGI PCR擴(kuò)增結(jié)果

3.3 5’RACE結(jié)果

見有900 bp左右的條帶（圖3），膠回收后與pMD-T載體連接過夜，再連接感受態(tài)細(xì)胞后，進(jìn)行陽(yáng)性重組子的篩選，挑取單菌落搖菌6～8 h后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒驗(yàn)證結(jié)果見條帶與PCR膠回收條帶大小一致（圖4）。

3.4 基因全長(zhǎng)的獲得

將3.2及3.3的結(jié)果進(jìn)行拼接后，重新設(shè)計(jì)引物合成CCDC85B的全長(zhǎng)，PCR的結(jié)果及質(zhì)粒PCR驗(yàn)證的結(jié)果如圖5和圖6所示。并使用SalⅠ做單酶切，用HindⅢ和KpnⅠ做雙酶切，結(jié)果如圖7所示。

將驗(yàn)證后的質(zhì)粒測(cè)序后，得到的序列如下（1 282 bp）：

BLAST同源性比對(duì)結(jié)果：（1）Bos taurus coiledcoil domain containing 85B（CCDC85B），mRNA，同源性為100%；（2）Homo sapiens coiled-coil domain containing 85B（CCDC85B），mRNA，同源性為83%。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 282 bp序列，其中編碼區(qū)（438-1046）為606 bp，編碼202個(gè)氨基酸殘基。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從本課題組前期建立的Long-SAGE基因文庫(kù)中，挑選出CCDC85B基因的17 bp標(biāo)簽作為基因特異性引物，通過GLGI技術(shù)和RACE技術(shù)的結(jié)合，經(jīng)過兩次PCR和長(zhǎng)距離（LD）PCR成功地克隆出奶山羊乳腺組織中的基因CCDC85B的全長(zhǎng)。目前國(guó)內(nèi)外尚無對(duì)乳腺此基因研究的報(bào)道，為進(jìn)一步進(jìn)行該基因結(jié)構(gòu)分析和研究該基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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Amplification and cloning of CCDC85B sequence from mammary gland of dairy Goat

ZHAO Jing,YAN Hong-bo,SUN Rui-qiu,LI Qing-zhang,GAO Xue-jun
（Key Laboratory of Dairy Science Ministry of Education Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Cloning of CCDC85B sequence from mammary gland of dairy goat.The SAGE Tag was elongated by GLGI to several hundreds base pair of EST,and the full length gene sequence was obtained by 5’RACE.The sequence of gene CCDC85B contains 1282 bp nucleotides.The gene encodes 202 amino acid residues,and had the highest similarity with bos and,human,the percent identities being100%and 83%.The results showed that the gene CCDC85B was reliably gained,and established foundation for construction analysis and function study of the gene.

dairy Goat;mammary gland;CCDC85B;GLGI;RACE

Q78，TS252.1

A

1001-2230（2011）01-0012-03

2010-10-19

趙婧（1986-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。

李慶章