胡博，梁金鐘

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱150076）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化鼠李糖乳桿菌L7-13增菌因子

胡博，梁金鐘

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，哈爾濱150076）

采用響應(yīng)面方法對鼠李糖乳桿菌L7-13的增菌因子進(jìn)行了優(yōu)化。以MRS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上添加增菌因子；采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，對幾種乳酸菌生長促進(jìn)因子對鼠李糖乳桿菌L7-13的增菌影響進(jìn)行評價(jià)；篩選出對鼠李糖乳桿菌L7-13增菌效果顯著的3種物質(zhì)以其最佳添加量；然后用旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法確定了3種顯著增菌因子的最佳配比。在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，鼠李糖乳桿菌L7-13的菌體濃度達(dá)到8.1×1010mL-1，比優(yōu)化前的活菌數(shù)7.9×108mL-1提高了近百倍。表明此增殖優(yōu)化培養(yǎng)基適于鼠李糖乳桿菌L7-13菌株的生長繁殖。

鼠李糖乳桿菌；響應(yīng)曲面；增菌因子

0 引言

益生菌鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus GG，簡稱LGG)從健康人的腸道中分離得到[1-3]，因其具有的益生特性和自身特點(diǎn)而被深入研究和廣泛應(yīng)用[5]。

隨著益生菌研究不斷深入，也出現(xiàn)了一些問題，比如市售的益生菌產(chǎn)品不但所用的菌種不同，而且在活菌含量、產(chǎn)品中的穩(wěn)定性、耐酸性、耐膽汁性及有無腸溶性等方面的差別，也會明顯影響有效性[6]。

響應(yīng)面法(Response surface methodology,RSM)是一種優(yōu)化過程的綜合技術(shù),它可快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件,該法己經(jīng)廣泛地應(yīng)用于各類培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件的優(yōu)化實(shí)踐中[10，11]。

因此，本實(shí)驗(yàn)基于以上因素，選取鼠李糖乳桿菌L7-13菌株，在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，利用Design Expert軟件(Version 6.0)響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，對培養(yǎng)基的增菌因子進(jìn)行優(yōu)化，最終達(dá)到增菌的目的。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與設(shè)備

菌種為鼠李糖乳桿菌L7-13(Lactobacillus rhamnosus GG L7-13)株。

牛肉粉，蛋白胨，酵母粉，瓊脂粉，無水乙酸鈉，葡萄糖，磷酸氫二鉀（生化試劑），蜂蜜（市售），豆?jié){，紅棗汁（自制），低聚果糖，乳清粉，酪蛋白水解物（食品添加劑）。

1.2 儀器設(shè)備

721型分光光度計(jì)，LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，超凈工作臺，DHG-9203型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，PHS-3C型pH計(jì)，DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 培養(yǎng)基

活化和計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（MRS基礎(chǔ)培養(yǎng)基）：蛋白胨1.00 g，牛肉粉1.00 g，酵母粉0.50 g，葡萄糖2.00 g，吐溫80 1.00 mL，乙酸鈉0.50 g，檸檬酸二銨0.20 g，MgSO4·7H2O 0.058 g，MnSO4·4H2O 0.025 g，K2HPO40.20 g，蒸餾水100 mL，pH值為6.2～6.4，121℃滅菌15 min后備用。

1.4 方法

1.4.1 菌種的活化與傳代培養(yǎng)

將斜面保藏菌種接種于MRS固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，得到純菌種后，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的接種量傳代培養(yǎng)于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，作為種子液備用[7-9]。

1.4.2 顯著增菌因子的篩選

采用單因素實(shí)驗(yàn)，以MRS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選取添加一定量的豆?jié){、紅棗汁、乳清粉、蜂蜜、酪蛋白水解物、低聚果糖等可能促進(jìn)乳酸菌的生長的增菌因子作為考察對象，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，分別測其活菌數(shù)，以MRS培養(yǎng)基+0(g)mL/100 mL各生長因子為空白對比實(shí)驗(yàn)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，從而篩選出顯著增菌因子。

其中各組分的質(zhì)量濃度分別為：豆?jié){、紅棗汁5.0～15.0 mL/100 mL，乳清粉0.5～4.0 g/100m L，蜂蜜1.0～4.0 g/100 mL，酪蛋白水解物的添加量0.3～4.0 g/100 mL、低聚果糖0.5～3 g/100 mL。

1.4.3 優(yōu)化混合增菌因子的配比

篩選出影響鼠李糖乳桿菌L7-13株的幾種顯著增菌因子后，采用旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)(Central Composite Rotatable Design，CCRD)法，對其混合增菌因子進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化配比，以獲得該菌體的混合增菌因子的配方。

中心組合設(shè)計(jì)的總實(shí)驗(yàn)總數(shù)為2K+2K+n0，其中K為自變量總數(shù)，n0為中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)數(shù)。自變量Xi按下式進(jìn)行編碼變換：

式中：Xi為自變量Xi的編碼值，X0為自變量Xi在中心點(diǎn)的值，△xi為自變量變化步長。

用標(biāo)準(zhǔn)多項(xiàng)式回歸方法，對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，便得到一個二次多項(xiàng)式，該方程為描述響應(yīng)量(應(yīng)變量)和自變量關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。對?因子系統(tǒng)，模型可描述為：

式中：Y為預(yù)測響應(yīng)值；β0為截距；βi為線性系數(shù)；βij為平方系數(shù)；βij為交互作用系數(shù)。

本階段實(shí)驗(yàn)輔助軟件為Design Expert軟件(Version 6.0)。實(shí)際考察的變量及其實(shí)驗(yàn)水平編碼如表1所示；采用多元回歸技術(shù)，擬合二次多項(xiàng)模型的CCRD設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示。

1.4.4 活菌數(shù)測定

采用稀釋平板計(jì)數(shù)法，將菌液10倍遞增稀釋到合適濃度后，取3個適當(dāng)稀釋度，各抽取0.1 mL菌液于滅好菌的培養(yǎng)皿中，倒入融化好的MRS固體培養(yǎng)基，混合均勻，每個稀釋度做3個重復(fù)實(shí)驗(yàn)，待凝固后，放入恒溫箱，37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)菌落數(shù)（菌落數(shù)在30～300個內(nèi)有效）[9]。

活菌數(shù)=稀釋度×平均活菌數(shù)/個平皿×0.1 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯著增菌因子的篩選及其最佳濃度的確定

MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加一定量的豆?jié){、紅棗汁、乳清粉、蜂蜜、酪蛋白水解物、低聚果糖，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的接種量接入100 mL三角瓶中，37℃恒溫培養(yǎng)48 h，測其活菌數(shù)，與不加增菌因子接種在MRS培養(yǎng)基的鼠李糖乳桿菌L7-13進(jìn)行比較，并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)直方圖如圖1-圖6所示。

圖1 紅棗汁的添加量對L7-13的影響

圖2 豆?jié){的添加量對L7-13的影響

圖3 酪蛋白水解物添加量對L7-13的影響

圖4 乳清粉添加量對L7-13的影響

圖5 低聚果糖添加量對L7-13的影響

圖6 蜂蜜添加量對L7-13的影響

進(jìn)行單因素方差分析可知：豆?jié){(P=0.12068)、紅棗汁(P=0.115275)、乳清粉(P=0.000668)、蜂蜜(P=0.123862)、酪蛋白水解物(P=2.64×10-5)、低聚果糖(P=1.59×10-5)所以，乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖是影響鼠李糖乳桿菌L7-13增殖的顯著增菌因子。因此，選擇乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖作為L7-13的顯著生長因子，進(jìn)一步考察它對L7-13生長的影響。其他可信度較小的因素對L7-13的增殖無明顯影響，在下一步的培養(yǎng)基優(yōu)化中可不考慮。

2.2 響應(yīng)曲面法(RSM)優(yōu)化混合增菌因子的配比

2.2.1 L7-13菌體濃度多元二次模型方程的建立及檢驗(yàn)

從以上單因素實(shí)驗(yàn)可知，乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖是L7-13的顯著生長因子。因此以MRS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選擇以上3個因子為研究對象，以L7-13菌體濃度即活菌數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)旋轉(zhuǎn)中心組合實(shí)驗(yàn)如表1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行了20組實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如表2所示。

表1 旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及其編碼g/100mL

X1=(x1-2)/0.5；X2=(x2-2)/0.5；X3=(x3-1)/0.5。

通過Design expert軟件對表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得L7-13菌體濃度對乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖的二次多項(xiàng)式回歸方程為

表2 旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Y=80.66-5.60X1-5.44X2-2.71X3-17.19X12-15.42X22-15.17X32+0.050X1X2-0.30X1X3+0.33X2X3(3)

式中：Y為L7-13菌體濃度的預(yù)測值；X1，X2，X3分別為乳清粉、酪蛋白水解物和低聚果糖的編碼值。由以上方程得出的L7-13菌體濃度預(yù)測值如表2所示。該二次回歸方程及其各項(xiàng)的方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 L7-13菌體濃度二次多項(xiàng)模型及其各項(xiàng)的方差分析

由表3可以看出，該模型極顯著(P＜0.0001)，失擬項(xiàng)在α=0.1水平上不顯著(P=0.0775＞0.05)，而且經(jīng)分析計(jì)算，該模型的確定系數(shù)R2=0.9735，表明模型與實(shí)際情況擬合很好，因此該模型可用于預(yù)測L7-13的實(shí)際生長增殖情況。由表3回歸方程各項(xiàng)的方差分析表明，各因素對L7-13菌體濃度的線性效應(yīng)皆顯著；且各因素對L7-13菌體濃度的曲面效應(yīng)也顯著；X1X3，X2X3，X1X2的交互影響顯著。

2.2.2 L7-13菌體濃度響應(yīng)面交互作用與優(yōu)化

由方程(3)所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖如圖7～圖9所示。各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果可通過該組圖直觀反映出來。

由圖7可以看出，在本研究水平范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中乳清粉含量的增大，L7-13的菌體濃度增加，但其濃度超出一定量時，反而抑制了L7-13的增殖。即當(dāng)乳清粉質(zhì)量濃度處于1.64～2.21 g/100mL范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)途酃琴|(zhì)量濃度在1.79～2.07 g/100mL范圍內(nèi)時，才可獲得7.85×1010mL-1的較高的菌體濃度。

乳清粉中含有大量的乳糖和乳蛋白素,能夠?yàn)橹参锶闂U菌提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì),可刺激乳酸菌的生長繁殖。因此,它們是乳酸菌的天然促生長因子。

圖8顯示了乳清粉與酪蛋白水解物對L7-13增殖的交互影響效應(yīng)。由圖8可以看出，當(dāng)酪蛋白水解物在0.70～1.19 g/100 mL范圍內(nèi)時，當(dāng)乳清粉在1.70～2.15 g/100 mL范圍內(nèi)時，才可獲得7.76×1010mL-1的較高的菌體濃度。

由圖9可見，當(dāng)乳清粉質(zhì)量濃度為2.00 g/100mL，酪蛋白水解物范圍在1.17～0.83 g/100 mL內(nèi)時，低聚果糖的質(zhì)量濃度只需1.64～2.21 g/100 mL，就能達(dá)到L7-13菌體濃度的較大值7.47×1010mL-1，而繼續(xù)增加酪蛋白水解物和低聚果糖的質(zhì)量濃度對L7-13增殖均無益。

由此可見，乳酸菌的酶系比較單純，不能合成多種氨基酸、維生素和生長因子。因此，為使這些菌正常生長和大量增殖，除供給碳水化合物外，還必須補(bǔ)充其所不能合成的各種營養(yǎng)物質(zhì)。

通過對L7-13菌體濃度模型進(jìn)行求導(dǎo)和解逆矩陣，可以得到模型的極值點(diǎn)，乳清粉的添加量為1.92 g/100 mL，低聚果1.91g/100 mL，酪蛋白水解物0.95 g/100 mL，此時模型預(yù)測的最大響應(yīng)值為7.8×1010mL-1。為了證實(shí)預(yù)測結(jié)果，在上述優(yōu)化條件下和原始的菌體生長條件下分別進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得出實(shí)際菌體濃度為8.1×1010mL-1，可見該模型能較好地預(yù)測L7-13的菌體生長情況。

3 結(jié)論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)從幾種常見乳酸菌促生長因子中篩選出對鼠李糖乳桿菌增菌效果顯著的物質(zhì)及其最佳添加量，通過響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化其混合增菌因子的配方：乳清粉的添加量為1.92 g/100 mL，低聚果糖1.91 g/100 mL，酪蛋白水解物0.95 g/100 mL培養(yǎng)28 h后，測其活菌數(shù)從優(yōu)化前7.9×108mL-1提高到8.1×1010mL-1，提高了近百倍。表明此增殖優(yōu)化培養(yǎng)基適于鼠李糖乳桿菌L7-13菌株的生長繁殖，為后續(xù)研究以及產(chǎn)業(yè)化提供了依據(jù)。

4 展望

培養(yǎng)基優(yōu)化僅僅是益生菌鼠李糖乳桿菌L7-13株研究的一個方面，還有許多方面的問題有待我們繼續(xù)研究和探索，比如它的基因測序、耐受性、培養(yǎng)條件以及微膠囊化方面的問題都需要我們更加深入的探索。我國對于鼠李糖乳桿菌的研究和含鼠李糖乳桿菌產(chǎn)品的開發(fā)起步較晚，而且鮮有產(chǎn)品問世，還需廣大從事功能性保健食品開發(fā)和藥品研究的科研工作者共同努力。

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Studies on enriching factor of Lactobacillus rhamnosus L7-13 strain by response surface methodology

HU Bo,LIANG Jin-zhong
(Harbin University of Commerce,Harbin 150076，China)

Response surface methodology was used to optimize the MRS-based enriching factor of Lactobacillus rhamnosus L7-13 strain.According to the determination of viable count,the enriching effects of several additives were evaluated by using the single-factor test.screen out the main affecting factors on the Lactobacillus rhamnosus L7-13 strain.Then the central composite design and response surface analysis were used to determine the optimal levels of the main factors.Cultived in the optimized medium,the cell numerous of Lactobacillus rhamnosus L7-13 Strain increased from 7.9×108cfu/mL to 8.1×1010cfu/mL.Experiments showed that this media and culture conditions were suitable for growth and reproduction of Lactobacillus rhamnosus L7-13 strain.

Lactobacillus rhamnosus;Response surface methodology;Enriching factor

Q936

A

1001-2230（2011）01-0019-04

2010-09-20

胡博（1985-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。通訊作者：梁金鐘