一株多菌靈降解菌包埋條件及降解特性

竇晶晶,馮貴穎,呼世斌*,李 琳(.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,陜西 楊凌 700；.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院,陜西 楊凌 700；.中國水利水電第三工程局勘測設(shè)計研究院,陜西 西安 7006)

一株多菌靈降解菌包埋條件及降解特性

竇晶晶1,馮貴穎2,呼世斌2*,李 琳3(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院,陜西 楊凌 712100；3.中國水利水電第三工程局勘測設(shè)計研究院,陜西 西安 710016)

采用海藻酸鈉(SA)和聚乙烯醇(PVA)對 1株多菌靈降解菌進(jìn)行包埋,并對最佳包埋條件及包埋后的降解效果進(jìn)行研究.結(jié)果表明:SA包埋法的最佳條件為:菌液與2% SA按1:5體積比混合,在4% CaCl2溶液中室溫交聯(lián)24h.PVA包埋法的最佳條件為:菌液與10%PVA按1:5比例混合,在3%CaCl2溶液中室溫交聯(lián)24h.活化48h后,在30℃、 pH6的條件下,SA包埋的多菌靈降解菌對多菌靈的降解率可達(dá)80.4%.PVA包埋的降解菌的降解率為76.3%.

多菌靈；降解菌；包埋條件優(yōu)化；降解特性

多菌靈(MBC)是一種高效廣譜低毒的內(nèi)吸性殺菌劑,常用于蔬菜和谷類的病害防治,性質(zhì)穩(wěn)定難降解,易對生態(tài)環(huán)境造成威害.已有研究[1-2]結(jié)果表明,微生物降解是沉積環(huán)境中多菌靈去除的主要途徑.如果篩選的微生物抗不良環(huán)境能力較弱,將使其在自然環(huán)境中的降解性能受到影響.固定化微生物技術(shù)可以將優(yōu)勢菌種固定,可保持較高的活性[3],提高降解效率[4-5],且被固定化后的細(xì)胞具有反應(yīng)速率快、耐毒害能力強[6]等優(yōu)勢.固定化技術(shù)的包埋法是利用線性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物的加裹作用,使優(yōu)勢菌通過擴散進(jìn)入多孔載體內(nèi),或利用高聚物在形成凝膠時將優(yōu)勢菌包埋于內(nèi)部[7].包埋形成的載體可防止細(xì)胞滲出,但底物仍能滲入并與細(xì)胞發(fā)生作用.本研究探討海藻酸鈉與聚乙烯醇包埋多菌靈降解菌的條件和降解特性,以期為包埋技術(shù)在農(nóng)藥降解的研究方面提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

多菌靈降解菌株屬產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes sp.),由西北農(nóng)林科技大學(xué)污染控制研究中心從長期使用多菌靈的土壤中富集分離獲得.

多菌靈原藥純度為97.5%,海藻酸鈉(SA)、聚乙烯醇(PVA)等試劑均為分析純.

基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(g/L):NaCl 1.0,NH4NO31.0,K2HPO41.5,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.1,FeSO4·7H2O 0.01,蒸餾水1000mL , pH值調(diào)至7.0左右.

LB 培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 10.0,酵母膏 5.0,NaCl 5.0 .

1.2 實驗方法

1.2.1 SA包埋 在室溫條件下,按表 1所設(shè)定的比例,將 SA于蒸餾水中加熱至完全溶解,冷卻后與培養(yǎng) 48h的多菌靈降解菌的菌液混合均勻.用注射器將混合液滴入 CaCl2溶液中形成均勻小球,交聯(lián)一段時間后將固定化小球取出,用0.9%的NaCl溶液洗滌后保存?zhèn)溆?

表1 SA正交實驗表Table 1 The orthogonal experiment table of SA

SA包埋條件的確定:以交聯(lián)時間、SA和CaCl2濃度以及為因素,每個因素設(shè) 3個水平.以固定化小球?qū)Χ嗑`的去除率為目標(biāo)函數(shù),采用L9(34)正交表進(jìn)行正交實驗,確定最佳包埋條件.其他條件為:多菌靈初始濃度 250mg/L,菌液接入量20%(V/V)、LB培養(yǎng)基與固定化小球的體積比為 10:1,基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基加入量 25%(V/V)、溫度30℃,初始 pH6,搖床轉(zhuǎn)速為 150r/min,活化時間48h,培養(yǎng)時間48h.

1.2.2 PVA包埋 在室溫條件下,按表2所設(shè)定的比例,將PVA與SA按10∶1混合加熱至完全溶解,冷卻后與培養(yǎng) 48h多菌靈降解菌的菌液混合均勻.用注射器將其滴入 CaCl2的飽和硼酸溶液中成球,交聯(lián)一定時間后將固定化小球取出,用0.9%的NaCl溶液洗滌保存?zhèn)溆?

PVA包埋條件確定:選定交聯(lián)時間、PVA和CaCl2濃度為因素,并設(shè)3個水平.以固定化小球?qū)Χ嗑`的去除率為目標(biāo)函數(shù),采用 L9(34)正交表進(jìn)行正交實驗,探討最佳的包埋條件.其他條件為:PVA 濃度與SA濃度比例10∶1,多菌靈初始濃度、菌液接入量、基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基加入量等與

1.2.1 相同.

表2 PVA正交實驗表Table 2 The orthogonal experiment table of PVA

1.2.3 包菌小球的物理性質(zhì)測定 彈性系數(shù)的測定:選取3 顆形態(tài)完好、大小均勻的小球呈品字形置于載玻片上,并放上蓋玻片.測量載玻片與蓋玻片之間的高度H1,選取適當(dāng)?shù)捻来a置于蓋玻片上,測量固定化小球被壓縮后的高度H2,據(jù)式(1)計算固定化小球的彈性系數(shù).

式中:g為重力常數(shù),取值9.8N/kg.

包菌小球直徑的測定:選取 5個大小均勻的包菌小球,用游標(biāo)卡尺測其直徑,計算平均直徑.

傳質(zhì)性能的測定:選取50個小球于50mL紅墨水中.放置24h后,于460nm分別測定加入包菌小球前后的紅墨水吸光度,計算固定化小球吸附紅墨水的百分比,判斷傳質(zhì)性能的差異.

1.2.4 包埋小球降解能力的測定 降解菌的培養(yǎng):從平板上挑取多菌靈降解菌的單菌落,接種于50mL LB培養(yǎng)基中,于30℃、120r/min培養(yǎng)48h作為包埋菌液.

包菌小球的活化:將包菌小球置于 LB培養(yǎng)基中,于30℃、120r/min活化48h.

包菌小球降解條件的研究:將包菌小球置于多菌靈 250mg/L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中,于 30℃、120r/min培養(yǎng).采用三波長校正光度法對小球的降解能力進(jìn)行分析[8].

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:吸取多菌靈標(biāo)準(zhǔn)液 0,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00mL,用 1cm 石英比色皿,以鹽酸(HCl與H2O為1∶11)調(diào)節(jié)分光光度計零點,分別測定278、281和290nm波長的吸光度.根據(jù)ΔA = A281-(A278+ A290)/2計算校正吸光度ΔA ,再以ΔA為縱坐標(biāo),多菌靈的含量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

培養(yǎng)液中多菌靈的提取:取一定量的培養(yǎng)液,加 HCl酸化至 pH 1～2.用 CHCl3提取 2次,每次25mL,合并提取液,水洗1次,水洗液合并入水層,用于多菌靈測定.

1.2.5 包菌小球最適降解條件的研究 溫度:將活化后的包菌小球,置于含多菌靈的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中,在20,25,30,35,40℃搖床培養(yǎng)后,于48h取樣檢測多菌靈含量.

pH 值:將活化后的包菌小球,置于含多菌靈的不同pH值(5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0)的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中,30℃、120r/min搖床培養(yǎng),48h后取樣檢測多菌靈的含量.

接種量:按1:10,2:10,3:10的接種量接入活化后的包菌小球,于 30℃、120r/min搖床培養(yǎng),48h后取樣檢測多菌靈含量.

農(nóng)藥初始濃度:將活化后的包菌小球置于含多菌靈50,100,150,200,250和300mg/L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中,于30℃、120r/min 搖床培養(yǎng),48h后取樣檢測多菌靈含量.

活化時間:包菌小球于 LB培養(yǎng)基中活化24,36,48,60,72h后,置于含多菌靈的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中,30℃、120r/min搖床培養(yǎng),48h后取樣檢測多菌靈含量.

實驗均以不接菌液為空白,以相同菌液含量的游離多菌靈降解菌培養(yǎng)液為對照,按散菌的接入體積計算出相應(yīng)的包菌小球體積,每個處理重復(fù)3次.

2 結(jié)果與分析

2.1 SA包埋條件的確定

以交聯(lián)時間、SA和CaCl2濃度為因素,正交實驗結(jié)果見表3.

表3顯示,在所選取的3個因素中,對降解效果影響最大的是交聯(lián)時間,最小的是 CaCl2濃度.這是因為交聯(lián)時間不足,SA與鈣離子沒有充分形成鈣凝膠,導(dǎo)致包埋小球的強度不足,從而影響微生物的附著以及生長;交聯(lián)時間過長,凝膠的強度過高,影響包埋小球的傳質(zhì)性能,也無法獲得良好的去除效果[9].另外,SA 濃度越高,包埋后的小球傳質(zhì)性能越差,氧氣以及反應(yīng)底物的擴散阻力越大,固定化微生物反應(yīng)活性受到抑制[10].結(jié)果表明,SA濃度2%時,多菌靈降解菌的降解效果最好(80.4%).因此,后續(xù)實驗選取SA濃度2%,CaCl2濃度4%,交聯(lián)24h.

表3 SA正交實驗結(jié)果Table 3 The orthogonal experiment results of SA

2.2 PVA包埋條件的確定

選定交聯(lián)時間、PVA和 CaCl2濃度為因素,正交實驗得到的最佳包埋條件見表4.

表4 PVA正交實驗結(jié)果Table 4 The orthogonal experiment results of PVA

從正交實驗結(jié)果(表4)可以看出,3個因素中,對PVA包埋的降解效果影響大小依次是:交聯(lián)時間＞ PVA 濃度＞ CaCl2濃度.交聯(lián)時間越長,多菌靈的去除效果越差.PVA濃度對包埋效果的影響與海藻酸鈉的影響相似:即濃度越高,包埋后的小球密度越高,傳質(zhì)性能越差,氧氣以及反應(yīng)底物的擴散阻力越大,固定化的微生物反應(yīng)活性受到抑制[11].由于硼酸對微生物有毒性作用,包埋劑中的 SA作為多糖類天然高分子化合物,對微生物細(xì)胞有保護(hù)作用,因此提高了固定化細(xì)胞的相對活性[12].當(dāng)PVA濃度為10%時,48h多菌靈的去除率達(dá)到76.3%,而游離微生物在同樣條件下120h的降解率僅為70%[13].因此,確定PVA濃度10%、CaCl2濃度3%,交聯(lián)24h為最適包埋條件.

2.3 包菌小球的物理性質(zhì)

2.3.1 彈性系數(shù) 固定化小球的彈性系數(shù)直接表征小球的強度.當(dāng)SA的濃度為2%,3%和4%時,彈性系數(shù)分別為9.85,11.23和13.81N/m;當(dāng)PVA的濃度為 9%,10%和 11%時,彈性系數(shù)分別為14.82,16.50和18.60N/m.結(jié)果表明:同一包埋材料不同濃度的包菌小球彈性系數(shù)不同,包埋劑濃度越大,包菌小球的彈性系數(shù)越高.

2.3.2 傳質(zhì)性能 固定化小球?qū)δ械募t色物質(zhì)有吸附作用.若紅墨水的吸光度大,說明固定化小球吸收的紅色物質(zhì)少,傳質(zhì)性能較差,反之亦然.SA和PVA包埋小球的傳質(zhì)性能分別為27.2%和13.6%.

2.3.3 包菌小球直徑 SA包埋小球與PVA包埋小球的平均直徑分別為0.268cm和0.322cm.

2.4 包菌小球的最適降解條件

2.4.1 溫度對包菌小球降解多菌靈的影響 隨溫度的升高,包菌小球?qū)Χ嗑`的降解呈先升高后降低的變化(圖1).30℃,SA和PVA包菌小球?qū)Χ嗑`的降解效果最好,散菌、SA和 PVA包菌小球的多菌靈降解率分別為 63.6%,81.5%和73.3%.可以看出,通過SA和 PVA的包埋,多菌靈降解菌的降解效果高于未包埋的散菌.溫度從20℃提高到 30℃,SA包菌小球?qū)Χ嗑`的降解率較PVA包菌小球高約15%左右;繼續(xù)升高溫度,2種包菌小球的降解率均下降,尤以 SA包菌小球下降明顯.這可能是由于 SA機械性能較差,溫度升高,SA受熱軟化,內(nèi)部的多菌靈降解菌受到外界溫度的影響,致使活性降低.

圖1 溫度對包菌小球降解多菌靈的影響Fig.1 Temperature influence on carbendazim degradation rate of embedded bacteria

2.4.2 pH值對包菌小球降解多菌靈的影響圖2顯示,體系的pH值為5時,散菌、SA與PVA包菌小球的多菌靈降解率分別為20.0%,51.9%和56.8%.pH值為7時,散菌、SA與PVA包菌小球的多菌靈降解率分別為 40.3%,48.8%和 53.3%.研究結(jié)果表明,pH5.5～6.5范圍,多菌靈降解菌的降解率較高;在pH6時,SA與PVA包菌小球的降解率為 76.8%和 78.9%,散菌的降解率為 52.5%.研究結(jié)果說明,經(jīng)過SA和PVA的包埋,多菌靈降解菌的降解活性得到提高.

圖2 pH值對包菌小球降解多菌靈的影響Fig.2 pH influence on carbendazim degradation rate of embedded bacteria

這是因為體系的pH＜6時,H+濃度較高,H+可能會與某些營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合,并能從這些物質(zhì)或微生物細(xì)胞表面置換出某些陽離子,從而影響微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和活性,導(dǎo)致包菌小球?qū)Χ嗑`的去除率下降.當(dāng)體系的 pH＞7,OH-的濃度較高,會影響營養(yǎng)物質(zhì)的溶解度、微生物細(xì)胞表面的電荷平衡和膠體性質(zhì),也可能導(dǎo)致固定化細(xì)胞活性的降低,從而影響包菌小球?qū)Χ嗑`的去除率[14].

2.4.3 接種量對包菌小球降解多菌靈的影響圖 3表明,SA包埋中降解菌的接種量為 1:10,2:10,3:10時,降解8h,去除率分別為41.2%,43.5%和 45.2%;降解時間延長到 48h,去除率分別達(dá)到72.3%,74.6%和68.5%.從圖4可知,PVA包埋降解菌的接種量為1:10,2:10, 3:10時,降解8h,去除率分別為51.2%, 54.5%和55.6%;繼續(xù)增加到48h,去除率分別為74.6%,77.2%和76.8%.從8h到24h,降解率提高了約 15%,此時體系中的反應(yīng)底物、氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)等逐漸滲透到包菌小球內(nèi)部,微生物開始快速生長和大量繁殖.在24h～48h范圍,體系中的反應(yīng)底物、氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的滲透達(dá)到平衡,微生物之間、微生物細(xì)胞之間對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭,導(dǎo)致整體細(xì)胞活性的下降,到48h時降解達(dá)到平衡[15].

圖3 接種量對SA小球降解多菌靈的影響Fig.3 Inoculumconcentration influence on carbendazim degradation rate of SA embedded bacteria

圖3 、圖4表明,48h以后,多菌靈降解菌對多菌靈的去除基本不變.SA包埋法的 3種接種量,多菌靈的去除率分別為 74.2%,75.8%和 69.5%.PVA包埋法的3種接種量,多菌靈的去除率分別為 75.5%,78.1%和 77.1%.因此,確定多菌靈去除率最高的2:10為最佳菌接種量.

圖4 接種量對PVA小球降解多菌靈的影響Fig.4 Inoculumconcentration influence on carbendazim degradation rate of PVA embedded bacteria

2.4.4 多菌靈初始濃度對包菌小球降解多菌靈的影響 圖 5顯示,多菌靈濃度為 50mg/L時,多菌靈可完全降解.當(dāng)多菌靈濃度為100mg/L時,游離菌對多菌靈的降解率為 91%,2種包菌小球的多菌靈降解率維持在 100%.這可能是因為整個降解環(huán)境采用無任何碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基,微生物以多菌靈為唯一碳源,因此可以將多菌靈完全降解.在多菌靈濃度為 300mg/L時,游離菌、SA和 PVA包菌小球?qū)Χ嗑`的降解率分別為48.3%,56%和 60%.這可能是因為一種高濃度的碳源物質(zhì)在代謝時,會抑制活性酶系統(tǒng)代謝其他類型的的碳源基質(zhì),或者抑制其他碳源代謝途徑中的一種或者幾種關(guān)鍵酶的合成[16].

2.4.5 活化時間對包菌小球降解多菌靈的影響 活化時間增加,包菌小球降解多菌靈的效果呈現(xiàn)升高-降低的變化(圖 6).包菌小球的活化時間由 24h增加到 48h,多菌靈的去除率呈上升趨勢.活化24h,SA和PVA去除率分別為71.8%和71.2%;活化時間增加到48h,SA和PVA降解率分別提高到 78.2%和 80.3%.研究結(jié)果說明:固定化后的多菌靈降解菌,在 24～48h之間,處于指數(shù)生長期.超過48h,由于微生物進(jìn)入衰亡期,其降解效果大幅降低.因此,確定48h為最佳活化時間.

圖5 初始濃度對包菌小球降解多菌靈的影響Fig.5 The initial concentration influence on carbendazim degradation rate of embedded bacteria

圖6 活化時間對包菌小球降解多菌靈的影響Fig.6 The activation time influence on carbendazim degradation rate of embedded bacteria

3 結(jié)論

3.1 本實驗條件下包埋的最適條件為:SA濃度2%、CaCl2濃度4%,交聯(lián)24小時;PVA濃度10%、CaCl2濃度3%,交聯(lián)24h.培養(yǎng)48h后多菌靈的降解率分別為80.4%和76.3%.

3.2 最適溫度為30℃,SA與PVA包菌小球的多菌靈降解率為 81.5%和 73.3%,比游離菌分別提高了28.1%和15.3%.

3.3 反應(yīng)體系的最佳pH值為6,SA與PVA包菌小球的多菌靈去除率為 76.8%和 78.9%,比游離菌分別提高了46.3%和50.3%.

3.4 接種量為 2:10時,多菌靈去除率最高,SA PVA包埋的多菌靈去除率分別為 75.8%和78.1%.

3.5 多菌靈濃度100mg/L時,游離菌的降解率為91%;SA與PVA包菌小球可以將其完全降解;增加多菌靈的濃度,降解能力降低.

3.6 在最佳的活化時間(48h),SA與PVA包菌小球的去除率分別為78.2%和80.3%.

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Study on embedding conditions and degradation characteristics of a carbendazim degrading bacteria.

DOU Jing-jing1, FENG Gui-ying2, HU Shi-bin2*, Li Lin3(1. College of Resources and Environment, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China; 2. College of Science, Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling 712100, China; 3. Water Resources and Hydropower Survey and Design Institute of the Third Engineering Bureau, Xi’an 710016, China). China Environmental Science, 2011,31(3)：431～436

Embedding a carbendazim degrading bacteria with sodium alginate (SA) and polyvinyl alcohol (PVA), the optimal embedding conditions and the efficiency of degradation after embedding were studied. The optimal SA embedding condition is that the bacteria were mixed with 2% SA (1:5) and cross-link in 4% CaCl2for 24h at room temperature. The optimal PVA embedding condition is that the bacteria were mixed with 10% PVA (1:5) and cross-link in 3% CaCl2under the same condition. After 48h activation, at pH6and 30℃, the degradation rate of SA embedding carbendazim degrading bacteria can reach 80.4%, and the degradation rate of PVA embedding bacteria can reach 76.3%.Key words：carbendazim；degrading bacteria；optimization of embedded；degradation

X172

A

1000-6923(2011)03-0431-06

2010-07-26

中央環(huán)保專項資金(財建【200】號)

* 責(zé)任作者, 教授, hushibin2003@yahoo.com.cn

竇晶晶(1986-),女,河北邢臺人,碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物的研究.