凝結(jié)芽孢桿菌CICIM B1821發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究

田康明，石貴陽，王正祥

（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江南大學(xué)生物資源與生物能源研究中心，江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心，江蘇無錫 214122）

凝結(jié)芽孢桿菌CICIM B1821發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究

田康明，石貴陽，王正祥*

（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江南大學(xué)生物資源與生物能源研究中心，江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心，江蘇無錫 214122）

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）CICIM B1821是一株實驗室前期篩選獲得的產(chǎn)L－乳酸的嗜熱菌。該菌株在34～55℃范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的生長特性和產(chǎn)酸特性，50℃時獲得最高的比生長速率和最大的乳酸積累量。CICIM B1821能夠在pH為5.0～7.5的范圍內(nèi)保持高的菌體活性。氧氣的存在有利于CICIM B1821的快速生長，但會導(dǎo)致副產(chǎn)物的積累，而在不通氧的條件下該菌株也生長良好，同時產(chǎn)酸速率可高達(dá)5.63g/L·h?？刂茪?zhí)菨舛炔桓哂?0%的發(fā)酵條件下，發(fā)酵48h，可積累乳酸107.5g/L，副產(chǎn)物總和僅為1.05g/L，葡萄糖對乳酸的得率為97.5%，所產(chǎn)L－乳酸光學(xué)純度高于99%。此外，高濃度葡萄糖發(fā)酵實驗顯示，該菌株可在高滲透壓下利用20%葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸，發(fā)酵100h，可積累乳酸134g/L，副產(chǎn)物總和僅為1.12g/L，葡萄糖對乳酸的得率為92.0%。

凝結(jié)芽孢桿菌，嗜熱菌，L－乳酸，發(fā)酵生產(chǎn)

近年來，生物可降解聚合材料正在遍布日常生活和工業(yè)生產(chǎn)的方方面面。與石油來源的聚合材料相比，可降解、可再生的性能使得生物質(zhì)的聚合材料需求量不斷增加。而聚乳酸正是應(yīng)用最廣泛的生物質(zhì)可降解聚合材料之一[1]。目前，90%的聚乳酸均由生物法發(fā)酵生產(chǎn)的乳酸加工聚合而成[2]。因此，建立高效的乳酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝顯得尤為重要。乳酸由L－乳酸和D－乳酸兩種構(gòu)型的單體組成。由于其構(gòu)型不同，兩種單體及其聚合材料的應(yīng)用領(lǐng)域也有所差異。因此，工業(yè)生產(chǎn)中對乳酸的構(gòu)型提出了越來越高的要求，特別是在食品和醫(yī)藥及相關(guān)領(lǐng)域，高光學(xué)純度L－乳酸的應(yīng)用更為廣泛。傳統(tǒng)的L－乳酸生產(chǎn)菌種為米根霉，但所產(chǎn)L－乳酸光學(xué)純度不高，發(fā)酵溫度較低，發(fā)酵工藝不易操作等不足限制了傳統(tǒng)方法生產(chǎn)L－乳酸的發(fā)展[3]。嗜熱菌用于L－乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)則彌補(bǔ)了上述不足。凝結(jié)芽孢桿菌就是典型的代表。該菌種對營養(yǎng)成分要求不高，可以節(jié)約發(fā)酵成本；代謝快，可以縮短發(fā)酵周期；耐受溫度高，可以減少發(fā)酵過程中對冷卻水的消耗，同時也減少了染菌的可能。眾多研究中已經(jīng)實現(xiàn)了不滅菌的情況下直接發(fā)酵生產(chǎn)，大幅度降低了能耗[4]。本研究室前期篩選獲得一株嗜熱L－乳酸高產(chǎn)菌。為了進(jìn)一步實現(xiàn)該菌株的推廣應(yīng)用，本研究從生長和發(fā)酵最適溫度、pH、補(bǔ)料濃度、供氧情況等方面考察了該菌株的生長和發(fā)酵產(chǎn)酸的特性，并建立了高效的L－乳酸發(fā)酵工藝。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株來源Bacillus coagulansCICIM B1821，由江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心（CICIMCU，http://cicim－cu.jiangnan.edu.cn）提供；LB培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH 7.0，添加瓊脂2%即為固體培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基[5]（g/L）葡萄糖60，酵母膏10，蛋白胨10，無水MgSO40.25，輕質(zhì)CaCO310，pH 7.0～7.2（其中葡萄糖及碳酸鈣單獨滅菌）；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖150，酵母膏10，蛋白胨2，無水MgSO40.25，輕質(zhì)CaCO375，pH7.0～7.2（其中葡萄糖及碳酸鈣單獨滅菌）。

1.2 分批發(fā)酵實驗

1.2.1 搖瓶實驗 種子平板培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，50℃靜置培養(yǎng)過夜。

單菌落接種于液體種子培養(yǎng)基，250m L三角瓶中分裝40m L種子培養(yǎng)基，50℃下200r/m in培養(yǎng)6h，用于接種發(fā)酵培養(yǎng)基。

乳酸發(fā)酵于250m L三角瓶中進(jìn)行，每瓶分裝40m L發(fā)酵培養(yǎng)基，用四層牛皮紙和保鮮膜將瓶口的紗布包扎住，50℃靜置發(fā)酵60h。每隔6h取樣測定菌體量、耗糖及產(chǎn)酸情況。每個參數(shù)設(shè)置三個平行實驗，測定結(jié)果取平均值。

考察溫度對菌體生長和產(chǎn)酸影響時，由于不同溫度下發(fā)酵液的揮發(fā)情況不同，產(chǎn)酸濃度值通過體積換算進(jìn)行校正。如50℃發(fā)酵60h時實測濃度為35.0g/L，終體積為37m L，初始體積40m L，換算后濃度為：

1.2.2 發(fā)酵罐放大實驗

1.2.2.1 種子培養(yǎng)方式 LB平板50℃靜置培養(yǎng)過夜后，接單菌落于LB液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速200r/min，50℃搖床過夜培養(yǎng)。500m L三角瓶中分裝200m L種子培養(yǎng)基，5%接種量，50℃條件下，200r/m in培養(yǎng)6h，用于發(fā)酵罐接種。

1.2.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 15L攪拌式發(fā)酵罐，初始裝液量8L，罐上滅菌（121℃，20m in）。葡萄糖單獨滅菌后分批補(bǔ)加，控制補(bǔ)加后終濃度不高于10%，發(fā)酵結(jié)束殘?zhí)菨舛炔桓哂?%，總添加量根據(jù)具體實驗要求確定。20%葡萄糖發(fā)酵實驗，一次補(bǔ)加葡萄糖至終濃度20%。

1.2.2.3 其他發(fā)酵參數(shù) 發(fā)酵溫度50℃，調(diào)節(jié)pH至6.5，好氧階段采用氨水調(diào)節(jié)，厭氧階段采用25%的Ca（OH）2調(diào)節(jié)，好氧階段控制DO值不低于30%，接種量為5%。

1.3 分析方法

1.3.1 菌體量的測定 吸取0.5m L發(fā)酵液置于具塞刻度試管中，加1m L濃度為2mol/L的鹽酸，將發(fā)酵液中過量的CaCO3或Ca（OH）2全部溶解，去離子水定容到所需刻度。以水為空白，于600nm處測定OD值,1OD相當(dāng)于0.25g/L的細(xì)胞干重。

1.3.2 葡萄糖和L－乳酸的測定 利用生物傳感分析儀（SBA－40C，山東科學(xué)院生物研究所）測定殘?zhí)菨舛群蚅－乳酸產(chǎn)量。

1.3.3 總?cè)樗岷透碑a(chǎn)物的測定 高壓液相色譜法測定總?cè)樗岙a(chǎn)量。儀器：dionex p680，Shodex SUGARSH 1011；柱溫：50℃；流動相：0.01mol/L H2SO41m L/m in；檢測器：示差折光檢測器。

1.3.4 光學(xué)純度的測定 高壓液相色譜法測定L－乳酸的光學(xué)純度。儀器：dionex p680，Astec CLC－L；柱溫：24℃；流動相：5mmol/L CuSO41m L/m in；檢測器：dionex UVD170U；檢測波長：254nm。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 生長曲線的擬合、生長速率和比生長速率的計算均由繪圖軟件Origin 8.0輔助完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溫度對Bacillus coagulans CICIM B1821生長和發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

考察了不同溫度（34、37、42、45、50、55℃）對Bacillus coagulans CICIM B1821生長和發(fā)酵產(chǎn)酸的影響。

對比圖1中的數(shù)據(jù)可以看出，在不同的發(fā)酵溫度下，菌體生長狀況差異明顯。隨著發(fā)酵溫度的升高，菌體的倍增時間逐漸縮短，但是55℃條件下菌體的倍增時間沒有繼續(xù)縮短而是增加到接近42℃時的倍增時間。通過對生長曲線擬合和進(jìn)一步計算發(fā)現(xiàn)，42℃發(fā)酵溫度下，菌體獲得了最高的生長速率（見圖2），而在37℃發(fā)酵溫度下，菌體獲得了最高的菌體量，最大比生長速率和最高的乳酸積累量則在50℃發(fā)酵溫度下獲得（見圖3和表1）。

菌體生長是一個復(fù)雜的過程，眾多因素都影響著菌體的生長狀況，如溫度、pH、供氧強(qiáng)度、底物濃度、產(chǎn)物濃度等，其中溫度的影響往往是比較顯著的，菌體合成和代謝所依賴的各種酶都會受到溫度的顯著影響。M.V.Jones等人[6]研究了一株凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）中在TCA循環(huán)中起關(guān)鍵作用的四種酶的熱穩(wěn)定性能，發(fā)現(xiàn)其中三種酶最適作用溫度在60℃以上，而蘋果酸脫氫酶的最適作用溫度為43℃。這一結(jié)論可以從酶作用溫度的角度為本研究中42℃發(fā)酵溫度下菌體獲得最大生長速率提供理論依據(jù)。M.V.Jones等人對比發(fā)現(xiàn)，四種酶55℃條件下的比酶活較30℃條件下高出三倍多；本研究中則發(fā)現(xiàn)，55℃發(fā)酵溫度下菌體的最大比生長速率是34℃條件下的3.5倍，34℃發(fā)酵溫度下菌體的倍增時間則是55℃條件下的3.1倍。

發(fā)酵生產(chǎn)過程中，除了要考慮菌體生長的最適溫度，還涉及到溫度對產(chǎn)物合成的影響。對比乳酸產(chǎn)量的不同，確定50℃為后續(xù)研究的基礎(chǔ)發(fā)酵溫度。此外，對該菌株碳源利用情況的考察顯示，Bacillus coagulans CICIM B1821可以利用葡萄糖和木糖進(jìn)行乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)，這為后續(xù)開發(fā)利用纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸奠定了基礎(chǔ)。而目前廣泛使用的纖維素水解酶類在50℃條件下的酶活力是30℃條件下的三倍[7]。這也為選擇50℃作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)發(fā)酵溫度提供了參考。

表1 不同溫度對Bacillus coagulans CICIM B1821生長和產(chǎn)酸的影響

圖1 不同溫度對Bacillus coagulans CICIM B1821生長的影響

圖2 不同溫度對Bacillus coagulans CICIM B1821生長速率的影響

圖3 不同溫度對Bacillus coagulans CICIM B1821比生長速率的影響

2.2 不同pH對Bacillus coagulans CICIM B1821生長和發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

對比了不同初始pH對菌體生長和產(chǎn)酸的影響。從圖4可以看出，Bacillus coagulans CICIM B1821在5.0～7.0的pH范圍內(nèi)生長和產(chǎn)酸狀況差異不大,說明該菌株具有良好的pH耐受能力，可以在較寬的pH范圍內(nèi)正常生長和發(fā)酵產(chǎn)酸。pH為6.5時該菌株生長狀況和產(chǎn)酸能力相對較強(qiáng)，因此后續(xù)發(fā)酵罐放大實驗中調(diào)節(jié)pH為6.5。

圖4 不同pH對Bacillus coagulans CICIM B1821生長和產(chǎn)酸的影響

2.3 不同初始葡萄糖添加量對Bacillus coagulans CICIM B1821生長和發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

圖5 不同初始葡萄糖添加量對Bacillus coagulans CICIM B1821生長和產(chǎn)酸的影響

圖5中的菌體量和乳酸產(chǎn)量均為發(fā)酵60h結(jié)束時測得。1%的初糖很快被消耗，產(chǎn)酸只有2.5g/L。5%的初糖也幾乎被完全消耗，產(chǎn)酸42g/L。由于糖濃度適宜菌體生長良好，發(fā)酵結(jié)束獲得較高的菌體量。10%的初糖獲得了最高的菌體量和產(chǎn)酸量。發(fā)酵結(jié)束時，初糖為15%和20%時，殘留糖濃度分別為95g/L和153g/L。由于高濃度糖的抑制作用，菌體量和產(chǎn)酸水平均受到影響。

后續(xù)發(fā)酵罐放大實驗中，考察了分批補(bǔ)糖控制殘?zhí)菨舛炔桓哂?0%和20%葡萄糖一次補(bǔ)加兩種方式對發(fā)酵的影響。

圖6 Bacillus coagulans CICIM B1821在充分供氧條件下的生長曲線

2.4 種齡的確定

Bacillus coagulans屬于兼性厭氧菌，該菌株可以在氧氣充足的條件下快速生長，也可以在氧氣不足時緩慢生長。為了獲得高活性的菌體接種發(fā)酵，確定菌種的種齡就顯得尤為重要。從圖6中可以看出，50℃條件下，200r/m in充分供氧培養(yǎng)6h，菌種即進(jìn)入穩(wěn)定期；對數(shù)生長期為2～5h。

確定了種齡，后續(xù)發(fā)酵實驗采用好氧培養(yǎng)6h的種子接種發(fā)酵。

2.5 不同生長階段的菌體對發(fā)酵產(chǎn)酸的影響

兼性厭氧菌用于乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)可以采用兩種發(fā)酵方式，一種是全程厭氧發(fā)酵，菌體緩慢生長同步產(chǎn)酸；另一種是先好氧培養(yǎng)獲得高活性的菌體，再進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵產(chǎn)酸階段。通過考察菌體在好氧條件下的生長狀況，針對不同生長階段菌體活性不同的特點，分別對比了對數(shù)生長期前期、對數(shù)生長期中后期和未進(jìn)入對數(shù)生長期的三種生長階段的菌體的產(chǎn)酸情況。

圖7 Bacillus coagulans CICIM B1821在不同生長階段轉(zhuǎn)為厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸情況的對比

如圖7和表2所示，好氧培養(yǎng)4.5h后轉(zhuǎn)為厭氧，菌體活性較高，最終的菌體量也較多，但是產(chǎn)酸速率和最終的產(chǎn)酸量均較低。同時伴生的雜酸較多，葡萄糖對乳酸的得率偏低。好氧培養(yǎng)2.5h后轉(zhuǎn)為厭氧則獲得了最高的產(chǎn)酸速率，但是由于仍然伴隨著副產(chǎn)物的生成，葡萄糖對乳酸的得率仍低于全程厭氧的發(fā)酵方式。

2.6 Bacillus coagulans CICIM B1821利用20%葡萄糖厭氧發(fā)酵生產(chǎn)乳酸

前期研究顯示，該菌株可以耐受較高濃度的葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。但是，氧氣充足的情況下，該菌株在糖濃度20%的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長緩慢，延遲期長達(dá)30h，而厭氧條件下，該菌株可以利用20%葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，而且延遲期在10h以內(nèi)。

在15L發(fā)酵罐上，初始裝液量9L，初始糖濃度20%，未通氧。發(fā)酵100h，乳酸產(chǎn)量達(dá)134g/L，殘?zhí)?.5g/L，葡萄糖對乳酸的轉(zhuǎn)化率約92%，副產(chǎn)物有丙酮酸、乙酸、丁二酸、甲酸、富馬酸和乙醇等，副產(chǎn)物總和低于1.2g/L（見圖8和表2）。最高產(chǎn)酸速率為3.81g/L·h，所產(chǎn)乳酸的光學(xué)純度高于99%（見圖9）。

圖8 Bacillus coagulans CICIM B1821利用20%葡萄糖厭氧發(fā)酵生產(chǎn)乳酸

圖9 Bacillus coagulans CICIM B1821產(chǎn)L－乳酸的光學(xué)純度

表2 不同生長階段和不同補(bǔ)料方式對Bacillus coagulans CICIM B1821生長和產(chǎn)酸的影響

3 結(jié)論

Bacillus coagulansCICIM B1821是一株優(yōu)良的L－乳酸產(chǎn)生菌，在適宜的發(fā)酵條件下可以用于發(fā)酵生產(chǎn)高光學(xué)純度和高化學(xué)純度的L－乳酸。本研究確定了該菌株適宜的發(fā)酵產(chǎn)酸溫度為50℃，pH調(diào)節(jié)為6.5，采用全程厭氧發(fā)酵工藝，發(fā)酵過程中分批補(bǔ)加葡萄糖至終濃度不高于10%，實驗中獲得最高產(chǎn)酸速率為5.63g/L·h，發(fā)酵48h，積累乳酸107.5g/L，副產(chǎn)物總和僅為1.05g/L，葡萄糖對乳酸的得率為97.5%，所產(chǎn)L－乳酸光學(xué)純度高于99%。

采用全厭氧分批補(bǔ)料發(fā)酵工藝可以高效制備高光學(xué)純度和高化學(xué)純度的L－乳酸，同時該菌株耐受高濃度葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的特性也為發(fā)酵生產(chǎn)中節(jié)約操作成本奠定了基礎(chǔ)。

研究顯示，凝結(jié)芽孢桿菌在25～61℃均可以生長[8]。這一生長特性顯示了該菌種優(yōu)異的適應(yīng)性和廣泛的工業(yè)應(yīng)用潛力。此外，Bacillus coagulans CICIM B1821為野生菌株其自身的生長溫度特點也為各種生物材料用于該菌株的遺傳改良拓展了空間。Ree等人[7]已成功構(gòu)建了用于凝結(jié)芽孢桿菌和大腸桿菌穿梭表達(dá)的質(zhì)粒載體。同時來源于高溫微生物的復(fù)制元件也在凝結(jié)芽孢桿菌中得到了成功應(yīng)用，這表明進(jìn)一步改良凝結(jié)芽孢桿菌的產(chǎn)酸特性，以及用于其他產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)都有廣闊的應(yīng)用空間。

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Study on the production of L-lactate by Bacillus coagulans CICIM B1821

TIAN Kang-ming，SHI Gui-yang，WANG Zheng-xiang*

（Culture and Information Center of Industrial Microorganisms of China Universities，Center for Bioresource and Bioenergy，Jiangnan University，Wuxi214122,China）

Bacillus coagulans CICIM B1821 was selected for L-lactate production.Its optimal growth temperature and fermentation temperature were proved both at 50℃，and Bacillus coagulans CICIM B1821 presents good grow th and fermentation characteristics at temperature range from 34℃ to 55℃.Bacillus coagulans CICIM B1821 presented good grow th and fermentation characteristics at pH range from 5.0 to 7.5.The existence of oxygen was proved increasing both the biomass yield and the by-product concentration.The L-lactic acid purity was above 99%，the yield from glucose to lactate was 97.5%，and the total by-product amount was lower than 1.05g/liter，while the lactic acid concentration was 107.5g/liter during the no oxygen flowing fermentation process with glucose concentration no more the 10%.While fermentation 20%g lucose to lactate，and the total by-product a mount was lower than 1.12g/liter，while the lactic acid concentration was 134g/liter，and the yield from glucose to lactae was 92%.

Bacillus coagulans； thermophile； L-lactate； fermentation

TS201.3

A

1002－0306（2011）10－0245－05

2010－10－28 * 通訊聯(lián)系人

田康明（1985－），男，在讀博士研究生，研究方向：發(fā)酵工學(xué)。

中非國際合作重點項目（2009DFA31300）。