微波輔助蛋白質(zhì)水解效果穩(wěn)定性研究

杜雪莉，張鳳枰,2,3，劉耀敏，張凌晶*

(1.通威股份有限公司，四川 成都 610041；2.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001；3.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049；4.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

微波輔助蛋白質(zhì)水解效果穩(wěn)定性研究

杜雪莉1，張鳳枰1,2,3，劉耀敏1，張凌晶4,*

(1.通威股份有限公司，四川 成都 610041；2.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001；3.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049；4.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

目的：考察微波輔助蛋白質(zhì)水解效果的穩(wěn)定性。方法：以魚粉和豆粕為研究對象，采用微波輔助蛋白質(zhì)水解-柱后衍生-紫外檢測法測定氨基酸，通過比較分析一定時期內(nèi)魚粉和豆粕樣品氨基酸結(jié)果的變化，研究微波輔助蛋白質(zhì)水解效果的穩(wěn)定性。結(jié)果：在一定時期內(nèi)，采用微波輔助蛋白質(zhì)水解，進(jìn)口魚粉、豆粕樣品氨基酸測定結(jié)果RSD值均小于4.0%。結(jié)論：微波輔助蛋白質(zhì)水解效果的穩(wěn)定性好，可替代傳統(tǒng)蛋白質(zhì)酸水解方法，并為保證氨基酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性提供技術(shù)支持。

氨基酸分析；微波輔助蛋白水解；穩(wěn)定性

氨基酸分析廣泛應(yīng)用于食品、飼料、生物化學(xué)等研究領(lǐng)域[1-10]。在食品、飼料氨基酸分析中，通常采用酸水解-茚三酮柱后衍生-紫外檢測，使用專用的全自動氨基酸分析儀完成。在樣品前處理中，常規(guī)水解方法[11-12]是在(110±1)℃、6mol/L HCl溶液酸性環(huán)境下，水解22～24h。該法水解時間太長，耗時耗電，操作繁瑣，不利于快速檢測大量樣品[13-14]。近年來，微波水解儀已用于蛋白質(zhì)水解，作為氨基酸分析樣品前處理的手段之一[11-12]，一次水解僅耗時2h，一批次可處理25個樣品，是目前公認(rèn)的能快速完成蛋白質(zhì)水解的儀器。微波輔助水解技術(shù)的出現(xiàn)，可節(jié)約樣品前處理時間、降低檢測成本，大大提高氨基酸分析的效率。飼料中氨基酸檢測常規(guī)水解法與微波水解法的比較已有研究[9-10,12-14]。但是，儀器長期使用后，蛋白質(zhì)微波輔助水解是否完全，水解效果是否穩(wěn)定，至今為止未見相關(guān)報道。本實(shí)驗(yàn)選擇具有代表性的飼料蛋白原料——魚粉、豆粕為研究對象，對常規(guī)水解法、微波輔助水解法進(jìn)行比較，在一定時期內(nèi)，通過比較分析魚粉和豆粕樣品氨基酸檢測結(jié)果的變化，研究蛋白質(zhì)微波輔助水解效果的穩(wěn)定性，為保證氨基酸檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

魚粉、豆粕樣品 通威股份有限公司。

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 日本Hitachi公司；實(shí)驗(yàn)用水為美國MilliQ超純水；茚三酮(分析純)；氨基酸分離緩沖液及其衍生試劑按照L-8900儀器說明書配制；其他試劑均為優(yōu)級純。

CP225D電子天平 德國Sartorius公司；ETHOS 1微波水解儀 意大利Milestone公司；L-8900氨基酸全自動分析儀 日本Hitachi公司；BC/BD-379HBN樣品冷藏柜 海爾公司。

1.2 樣品前處理

1.2.1 常規(guī)酸水解法

參照文獻(xiàn)[11]酸水解前處理法。所有樣品重復(fù)4次測定，結(jié)果取平均值。

1.2.2 微波輔助蛋白水解法

參考儀器廠家提供方法及相關(guān)文獻(xiàn)研究[9,12]，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計，詳見表1。

表1 試驗(yàn)條件優(yōu)化L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計Table 1 Scheme and experimental results of L9(34) orthogonal array design

準(zhǔn)確稱取供試試樣10～20mg(準(zhǔn)確至0.01mg)于微波水解石英杯中，加入6mol/L鹽酸溶液0.5～1.0mL，依次放置于水解槽中，水解主控罐內(nèi)加入6mol/L鹽酸溶液120～150mL，蓋好水解罐。將水解罐放入密封裝置中，擰緊，插入溫度傳感器，抽真空，充入高純氮?dú)庖员Ｗo(hù)樣品，重復(fù)3次。在800W功率條件，不同水解溫度下水解不同時間，當(dāng)溫度冷卻至室溫后打開密封裝置，取出水解槽，將微波水解瓶逐一取下后，將水解液全部轉(zhuǎn)移至50～100mL容量瓶中，用去離子水定容，搖勻。經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，待上機(jī)測定。所有樣品重復(fù)4次取平均值。

1.3 氨基酸分析儀器條件

分離柱：4.6mm×60mm；柱溫：57℃；緩沖液流速：0.4mL/min；反應(yīng)柱柱溫：135℃；衍生緩沖液流速：0.35mL/min；除氨柱：4.6mm×40mm；檢測波長：通道1：570nm，通道2：440nm；上樣量：20μL；樣品凈分析時間：30min；檢測限：3pmol。1.4 測定和計算

按照上述前處理方法及儀器條件，待基線穩(wěn)定后，標(biāo)樣、供試品溶液分別等體積進(jìn)樣，進(jìn)行分析測定。樣品供試品溶液每6個樣品為一組，組間插入混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行校準(zhǔn)。以樣品峰的保留時間與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間定性，色譜峰面積定量，單點(diǎn)校正法計算樣品氨基酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 試樣的選擇

已有文獻(xiàn)報道，利用微波輔助水解法和常規(guī)水解法同時對豆粕、魚粉進(jìn)行前處理，測定結(jié)果表明微波水解與常規(guī)水解兩種方法相對穩(wěn)定一致并具有良好的重現(xiàn)性[9]。但微波水解儀經(jīng)長期使用后，其水解性能是否能保持穩(wěn)定是決定氨基酸檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可信的關(guān)鍵因素。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇2個進(jìn)口魚粉、1個豆粕為樣品，考察其水解效果的穩(wěn)定性。由于進(jìn)口魚粉、豆粕均不是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，考慮到其自身的穩(wěn)定性，因此，2個進(jìn)口魚粉的穩(wěn)定性考察時間均在3個月左右，豆粕要長一些，約為7個月。樣品均于0～4℃樣品冷藏柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 常規(guī)水解法和微波輔助水解法測定結(jié)果比較

不同的微波水解儀因儀器參數(shù)不一，選擇的水解條件可能會有所不同，與常規(guī)水解法進(jìn)行比較，經(jīng)正交試驗(yàn)確定最佳微波輔助水解條件為A3B2，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，兩種水解方法測定結(jié)果的相對偏差均小于4.0%，符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18246—2000《飼料中氨基酸的測定》規(guī)定要求[11]，經(jīng)t檢驗(yàn)，微波輔助水解法與常規(guī)水解法測定結(jié)果不存在顯著差異(P＜0.05)，在所選擇的條件下微波輔助蛋白質(zhì)水解測定結(jié)果與常規(guī)法一致。

表2 進(jìn)口魚粉、豆粕常規(guī)水解法與微波水解法氨基酸檢測結(jié)果比較(n=4)Table 2 Comparison of amino acid composition of hydrolysates of fish meal and soybean meal resulting from microwave-assisted acid hydrolysis and routine acid hydrolysis (n=4)

2.3 進(jìn)口魚粉水解效果穩(wěn)定性考察

表3 進(jìn)口魚粉1號微波輔助水解穩(wěn)定性結(jié)果(n=4)Table 3 Stability of microwave-assisted acid hydrolysis of fish meal 1 (n=4) %

表4 進(jìn)口魚粉2號微波輔助水解穩(wěn)定性結(jié)果(n=4)Table 4 Stability of microwave-assisted acid hydrolysis of fish meal 2 (n=4) %

為考察微波輔助蛋白水解效果的穩(wěn)定性，按照所選擇的條件和方法，分別于2009年2月24日、3月12日、3月20日、4月10日完成進(jìn)口魚粉1號樣品氨基酸含量的測定，2009年6月5日、7月8日、7月30日、8月8日完成進(jìn)口魚粉2號樣品氨基酸含量的測定，4次測定結(jié)果分別見表3、4。結(jié)果表明，進(jìn)口魚粉1號和2號樣品屬不同批次樣品，分別在不同時間下進(jìn)行測試，同一魚粉樣品參與比較分析的18種氨基酸及其總量，除酪氨酸、脯氨酸外，其結(jié)果的RSD值均小于4.0%；經(jīng)t檢驗(yàn)，同一魚粉樣品在不同時間的氨基酸含量測定結(jié)果均不存在顯著差異(P＜0.05)。本實(shí)驗(yàn)室所用氨基酸分離緩沖液及其衍生試劑均為購買國產(chǎn)或進(jìn)口試劑自行配制，配方經(jīng)優(yōu)化、驗(yàn)證表明可用，但酪氨酸出峰時間恰好是基線切換時間點(diǎn)，因此可能會導(dǎo)致酪氨酸偏差略高。但酪氨酸、苯丙氨酸測定值之和比較穩(wěn)定，并未影響氨基酸總量的檢測結(jié)果。2.4 豆粕微波輔助水解效果穩(wěn)定性考察

按照上述方法，2009年9月12日、2009年11月5日、2010年1月11日、2010年3月21日完成同一豆粕樣品氨基酸含量的測定，考察豆粕微波輔助水解效果的穩(wěn)定性，4次測定結(jié)果見表5。從表5可知，豆粕樣品在半年多的試驗(yàn)過程中，18種氨基酸及其總量的測定結(jié)果的RSD值均小于4.0%；經(jīng)t檢驗(yàn), 同一豆粕樣品在不同時間的氨基酸含量測定結(jié)果均不存在顯著差異(P＜0.05)。由此可見，使用微波水解儀輔助蛋白水解完全可以滿足豆粕氨基酸檢測的需求。

表5 豆粕微波輔助水解穩(wěn)定性結(jié)果(n=4)Table 5 Stability of microwave-assisted acid hydrolysis of soybean meal (n=4) %

3 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)，微波輔助蛋白質(zhì)水解效果不會因氣候、環(huán)境溫度、樣品的變化而發(fā)生波動。參與研究的進(jìn)口魚粉的18種氨基酸及其總量檢測結(jié)果除酪氨酸、脯氨酸外，RSD值均小于4.0%，豆粕試樣中18種氨基酸及其總量的檢測結(jié)果RSD值均小于4.0%，滿足GB/T 18823—2002《飼料檢測結(jié)果判定的允許誤差》[15]的要求。特別是蛋氨酸、賴氨酸和氨基酸總量3個關(guān)鍵指標(biāo)的穩(wěn)定性高，其RSD值均不超過2.0%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明微波輔助蛋白質(zhì)水解效果穩(wěn)定性好。

使用微波加熱水解樣品，加熱方式與傳統(tǒng)的加熱方式截然不同，試樣溫度上升速度快。此外，由于反應(yīng)罐耐高溫高壓，反應(yīng)可在較高的溫度下進(jìn)行，反應(yīng)速度快，反應(yīng)時間約為常規(guī)方法的1/10，從稱樣到完成水解全過程僅耗時2h。微波水解液可直接用超純水稀釋定容，經(jīng)濾膜過濾后直接上機(jī)分析，簡化了操作，大大節(jié)約試劑和實(shí)驗(yàn)用電，降低檢測成本。此外，使用微波水解儀輔助蛋白質(zhì)水解，一次最多能處理25個樣品，完全能夠滿足氨基酸全自動分析儀1d的分析量，節(jié)約了氨基酸分析儀預(yù)熱、再生、平衡及沖洗時間，大大提高了效率，能滿足質(zhì)檢機(jī)構(gòu)和相關(guān)企業(yè)氨基酸組分檢測需求。

微波輔助蛋白質(zhì)水解方法具有操作快速、簡捷、方便、高效、環(huán)保，可作為氨基酸分析樣品前處理方法，用于批量樣品的快速檢測。

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Stability of Microwave-assisted Acid Hydrolysis of Protein

DU Xue-li1，ZHANG Feng-ping1,2,3，LIU Yao-min1，ZHANG Ling-jing4,*
(1. Tongwei Co. Ltd., Chengdu 610041, China；2. Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining 810001, China；3. Graduate University of the Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049, China；4. College of Biotechnology, Jimei University, Xiamen 361021, China)

In this study, fish meal and soybean meal were used as substrate to compare microwave-assisted acid hydrolysis and routine acid hydrolysis by determining the amino acid composition of hydrolysates on an auto-amino acid analyzer. Meanwhile, in order to evaluate the stability of microwave-assisted acid hydrolysis, two imported fish meal samples and one soybean meal sample were subjected to microwave-assisted acid hydrolysis and amino acid determination (the same samples were hydrolyzed and analyzed at four different dates). The results showed that the relative standard errors for the determination of each of the three samples at different dates were less than 4%. Therefore, microwave-assisted acid hydrolysis has a good stability and can be used as an alternative to routine acid hydrolysis and provide technical supports for accurate determination of amino acids.

amino acid analysis；microwave-assisted acid hydrolysis of protein；stability

Q517

A

1002-6630(2011)08-0121-04

2010-06-30

福建省高校水產(chǎn)科學(xué)技術(shù)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金項(xiàng)目(20095402)

杜雪莉(1978—)，女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全檢測。E-mail：xldu2000@126.com

*通信作者：張凌晶(1983—)，女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：imzlj@jmu.edu.cn