蘆葦葉類黃酮高效液相色譜分析

孫麗芳，劉鄰渭*，呂俊麗，李 旋

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

蘆葦葉類黃酮高效液相色譜分析

孫麗芳，劉鄰渭*，呂俊麗，李 旋

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

目的：分析蘆葦葉類黃酮的組分。方法：制備蘆葦葉類黃酮提取濃縮過程中形成的析出物和濃縮液再經(jīng)大孔樹脂純化后產(chǎn)生的初純物，優(yōu)化兩種樣品中類黃酮苷轉(zhuǎn)化為苷元的水解條件，采用高效液相色譜(HPLC)法測定兩種樣品和其水解樣品類黃酮的組分。結(jié)果：析出物和初純物的總黃酮含量分別為57.1%和18.5%，酸濃度1.4mol/L、溫度80～90℃條件下水解4h可獲得相對最好的水解效果；HPLC測定表明，析出物含32種組分，其中7種得到確定，初純物含22種組分，其中5種得到確定；水解析出物含28種組分，其中7種得到確定，水解初純物含25種組分，其中7種得到確定。結(jié)論：蘆葦葉含有蘆丁、野黃芩苷、橙皮苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚、異鼠李素(或橙皮素)、異甘草素和黃芩素，其中芹菜素含量最高，還有許多未確定的類黃酮。

蘆葦葉；類黃酮；水解；高效液相色譜(HPLC)

蘆葦(Phragmites communisTrin)為多年生禾本科蘆葦屬植物，它生長力強、分布廣，具有“第二森林”的美譽[1]。蘆根為一種中藥材，蘆葉、蘆花、蘆莖也含有豐富的藥理成分，如戊聚糖、薏苡素、兩種糖醛酸以及VB1、VB2、VC等[2]。在蘆葦?shù)默F(xiàn)代科學(xué)研究中，類黃酮是關(guān)注點之一。據(jù)報道，蘆葦中含有木犀草素、槲皮素以及異鼠李素等黃酮苷元與葡萄糖等單糖以O(shè)-糖苷鍵和C-鍵直接鏈接而成的類黃酮，是極好的天然抗氧化劑[3-4]。

有關(guān)研究說明，類黃酮苷被水解成苷元后，其生物利用率和清除人體自由基的生物活性明顯提高。這是因為類黃酮進入人體代謝時，其苷元形式可以直接被吸收進入血液中，而大部分類黃酮苷不能通過小腸壁直接進入血液，需在腸內(nèi)益生菌分泌的水解酶作用下水解成苷元，再被吸收進入血液[5-7]。

在曾對蘆葦葉總黃酮提取分離并測定了其體外抗氧化功能的基礎(chǔ)上[8-10]，本研究選擇蘆葦葉總黃酮提取液濃縮時析出的結(jié)晶物和濃縮液再經(jīng)大孔樹脂純化后所得的類黃酮初純物為樣品，將兩種樣品進行鹽酸水解條件的優(yōu)化，應(yīng)用高效液相色譜對兩種樣品水解前后的色譜圖進行類黃酮組分分析，部分確定其中的類黃酮苷和苷元，為進一步探索和利用蘆葉類黃酮提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆葦葉于5、6月份采自西安市楊凌區(qū)渭河灘，室溫自然干燥，粉碎。

蘆丁、野黃芩苷、橙皮苷、槲皮素、芹菜素、異鼠李素、異甘草素、黃芩素、山奈酚、橙皮素、木犀草素(均為標準品，純度≥98%) 四川維克奇生物技術(shù)有限公司；鹽酸、甲醇、乙酸乙酯(均為分析純)中國醫(yī)藥集團(上海)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

1.3.1.1 蘆葦葉類黃酮提取液濃縮時析出物的制備

稱取蘆葦葉粉末350g，按料液比1:50加入70%乙醇，于70℃水浴提取3次，第1次提取1h，第2次和第3次分別提取30min，提取液抽濾后合并，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，此過程中有黑色固體析出，將其收集，于50℃烘干，粉碎成粉末待用(以下簡稱析出物)。

1.3.1.2 蘆葦葉類黃酮初純物的制備

將1.3.1.1節(jié)的濃縮液用石油醚萃取，除去葉綠素和蠟質(zhì)，然后轉(zhuǎn)入AB-8大孔吸附樹脂柱，當濃縮液流入柱床中后，關(guān)閉柱出口，靜態(tài)吸附1h，然后用3倍柱床體積的蒸餾水洗除水溶性雜質(zhì)，再用3倍柱床體積的70%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，40℃濃縮干燥，得蘆葦葉類黃酮初純物，粉碎成粉末待用(以下簡稱初純物)。

1.3.2 樣品的水解及前處理

精確稱取析出物和初純物粉末各10mg，分別放入不同水解管中，各管加入8mL甲醇和2mL一定濃度的鹽酸，密封后分置于一定溫度的恒溫水浴鍋中水解一定時間后，取出冷卻，抽濾后，用甲醇定容至50mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，將殘余溶液用乙酸乙酯萃取(30mL×3次)，合并乙酸乙酯相，定容至100mL，進行紫外測定，然后將其于40℃濃縮蒸干后，用10mL甲醇溶解，再用0.45μm濾膜過濾后，作為液相測定樣品。

1.3.3 未水解樣品的前處理

按照1.3.2節(jié)的步驟，但以蒸餾水代替鹽酸，且省去保溫水解步驟，并將溶解乙酸乙酯萃取物的甲醇由10mL改為6mL，得到析出物和初純物的前處理液的紫外測定結(jié)果和液相測定樣品。

1.3.4 樣品水解條件的優(yōu)化

1.3.4.1 鹽酸濃度的優(yōu)選

按照1.3.2節(jié)的方法，鹽酸濃度分別選為4、5、6、7、8mol/L，水浴溫度恒為80℃，水解時間恒為2h，對析出物和初純物分別進行5組水解處理，根據(jù)處理液在365nm吸光度的大小優(yōu)選鹽酸濃度。

1.3.4.2 水解時間的優(yōu)選

按照1.3.2節(jié)的方法，水解時間分別選為1、2、3、4、5h，鹽酸濃度恒為7mol/L，恒溫水浴溫度恒為80℃，對析出物和初純物分別進行5組水解處理，根據(jù)處理液在365nm吸光度的大小優(yōu)選水解時間。

1.3.4.3 水解溫度的優(yōu)選

按照1.3.2節(jié)的方法，水浴溫度分別選為50、60、70、80、90℃，鹽酸濃度恒為7mol/L，水解時間恒為4h，對析出物和初純物分別進行5組水解處理，根據(jù)處理液在365nm吸光度的大小優(yōu)選水解溫度。

1.3.5 色譜分析

1.3.5.1 色譜條件[11]

色譜柱：C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：20min的20%～40%乙腈溶液(用三氟乙酸調(diào)pH2.5)梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；柱溫：2 5℃；檢測波長：365nm；進樣量：20μL。

1.3.5.2 標準圖譜的制作

1)第1組混和標準樣品為蘆丁、木犀草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚、異甘草素、黃芩素，質(zhì)量濃度分別為 0.02、0.016、0.023、0.02、0.021、0.0168、0.023mg/mL甲醇溶液。

2)第2組混和標準樣品為蘆丁、野黃芩苷、橙皮苷、槲皮素、異鼠李素、山奈酚、橙皮素，質(zhì)量濃度分別為 0.02、0.022、0.021、0.023、0.016、0.021、0.022mg/mL甲醇溶液。

3)上機分析：開機預(yù)熱20min，設(shè)置色譜條件和參數(shù)，首先以20%乙腈溶液清洗柱子，待基線穩(wěn)定后，手動進樣，轉(zhuǎn)入梯度洗脫，由儀器工作站繪出標準圖譜，此后轉(zhuǎn)用20%乙腈水溶液清洗柱子，準備下次進樣。

1.3.5.3 樣品測定

按照標準圖譜制作時同樣的上機分析方法對1.3.2節(jié)制出的水解析出物和初純物樣液及1.3.3節(jié)制出的析出物和初純物樣液進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品制備

由1.3.1節(jié)制出的析出物為黑色粉末，總黃酮含量為57.1%，初純物為棕色粉末，總黃酮含量為18.5%。這說明，在蘆葦葉類黃酮提取液的濃縮過程中產(chǎn)生的析出物比初純物的總黃酮含量還高，所以，它和初純物都應(yīng)當作為制取蘆葦葉類黃酮重要物質(zhì)。

2.2 樣品水解條件優(yōu)化

2.2.1 鹽酸濃度的優(yōu)選

圖1 鹽酸濃度對水解的影響Fig.1 Effect of HCl concentration on hydrolysis degree

由圖1可知，使用的鹽酸濃度在7mol/L時，析出物和初純物水解樣液的吸光度均最高。當鹽酸濃度大于7mol/L時，吸光度轉(zhuǎn)而下降。365nm吸光度為測定多種類黃酮含量時常用的檢測指標，在本實驗中，其值的高低表明水解樣液中類黃酮、特別是其苷元濃度的高低。因此，選擇7mol/L的鹽酸用于調(diào)整水解液的酸度最佳，即水解液酸濃度控制為1.4mol/L。

2.2.2 水解時間的選擇

圖2 水解時間對水解的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree

由圖2可知，在水解時間為4h的條件下，析出物和初純物水解樣液的吸光度均最高。水解時間少于和多于4h時吸光度均較小。這說明4h的水解過程即可保證水解基本完成，又不因時間過長而加劇類黃酮和其苷元的損失。故選擇4h作為最佳水解時間。

2.2.3 水解溫度的選擇

圖3 水解溫度對水解的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree

由圖3可知，隨著水解溫度逐漸升高，析出物和初純物水解樣液的吸光度也逐漸升高，說明溫度的升高有利于水解反應(yīng)的進行；當溫度升至90℃時，析出物水解樣液的吸光度達到最高，初純物水解樣液的吸光度反而低于80℃時的，說明水解溫度也不宜太高，過高易造成類黃酮破壞。所以，析出物和初純物的最佳水解溫度分別選擇為90℃和80℃。

2.3 水解前后樣品HPLC圖譜分析

2.3.1 類黃酮標準品的HPLC圖譜

圖4 標準樣品的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of standard sample

由圖4可知，11種標準物質(zhì)的色譜峰間基本清晰分離，兩次重復(fù)測定(色譜圖省略)的結(jié)果說明：蘆丁、野黃芩苷、橙皮苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚、異鼠李素、橙皮素、異甘草素和黃芩素的保留時間分別為 5.146～5.179、7.001～7.094、9.515～9.701、15.971～16.164、16.354～16.393、19.875～20.138、21.088～21.223、21.645～21.741、21.673～21.741、22.136～22.244min和24.182～24.288min，其中異鼠李素和橙皮素之間在此色譜條件下難以分離。

2.3.2 水解前后析出物的HPLC圖譜分析

按1.3.5.3節(jié)制作的樣品圖譜見圖5、6。

圖5 析出物(A)和水解析出物(B)的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of crude extract (A) and hydrolysates of crude extract (B)

由圖5A可知：析出物中含有蘆丁、野黃芩苷、橙皮苷、槲皮素、芹菜素、異鼠李素(或橙皮素)、異甘草素、黃芩素這7種物質(zhì)，且芹菜素的含量最高，異鼠李素(或橙皮素)的含量次之，另外還有大約25種物質(zhì)有待進一步研究確定。由圖5B可知：水解析出物的樣液含有野黃芩苷、橙皮苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚、異鼠李素(或橙皮素)這7種物質(zhì)。另外還有大約21種物質(zhì)有待進一步研究確定。

比較圖5A、5B可知：水解前后均有保留時間短于4.5min的物質(zhì)穩(wěn)定存在；水解前保留時間在5.7～12.2min的物質(zhì)，水解后大部分消失或減少，說明此類物質(zhì)大部分可以被水解，極可能是類黃酮-O-糖苷(包括木犀草素、槲皮素苷、芹菜素苷、山奈酚苷等)；水解后保留時間在14min之后的一些物質(zhì)峰面積增加，對照標準圖譜可以確定這些物質(zhì)包含木犀草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚和異鼠李素(或橙皮素)；析出物水解后的樣品圖譜中出現(xiàn)了保留時間在26～28min的兩種物質(zhì)，雖無法確證，但極可能是比黃芩素極性還小的苷元。

2.3.3 水解前后初純物的HPLC圖譜分析

圖6 初純物(A)和水解初純物(B)的HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatographs of primarily purified sample (A) and hydrolysates of primarily purified samples (B)

由圖6A可知：初純物中含有蘆丁、野黃芩苷、橙皮苷、芹菜素、異鼠李素(或橙皮素)這5種物質(zhì)，另外還有大約17種物質(zhì)有待進一步研究確定。由圖6B可知：水解初純物中含有野黃芩苷、橙皮苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚、異鼠李素(或橙皮素)這7種物質(zhì)，且芹菜素的含量最高。另外還有大約18種物質(zhì)，有待進一步研究確定。

比較圖6A、6B可知：水解前后均有保留時間短于4.2min的物質(zhì)穩(wěn)定存在；水解前保留時間在4.6～12.15min之間出現(xiàn)的物質(zhì)水解后大部分減少(如野黃芩苷、橙皮苷)或消失(如蘆丁)，而木犀草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚、異鼠李素(或橙皮素)都比未水解時增加，同時新出現(xiàn)了保留時間為5.740、6.186min的兩種物質(zhì)。提示初純物中的此類物質(zhì)大部分可以被水解，應(yīng)該是O-糖苷鍵鏈接的類黃酮苷，這些苷包含蘆丁、野黃芩苷和橙皮苷。

2.3.4 對色譜圖中未確定峰的討論

Mahmoud等[12]發(fā)現(xiàn)蘆葦花中含有日當藥黃素和異日當藥黃素的C-糖苷，含有日當藥黃素-3-O-龍膽雙糖苷、日當藥黃素-3-O-葡萄糖苷、鼠李亭-3-O-蕓香糖和鼠李亭-3-O葡萄糖苷。Maurice等[13]發(fā)現(xiàn)蘆葦葉中含有4種黃酮醇糖苷、1種黃酮糖苷和6種C-黃酮糖苷；后者中包含7,3-二甲基異東方廖黃素。戴軍等[3]從蘆葦葉中檢測出9種類黃酮，其中包括木犀草素-6-C-雙葡萄糖甙和木犀草素-5-C-三葡萄糖甙。根據(jù)這些報道，本實驗中的析出物和初純物所含有的保留時間在12min以前的峰所對應(yīng)的物質(zhì)很可能包含這些苷類。另外，根據(jù)木犀草素-6-C-雙葡萄糖甙和木犀草素-5-C-三葡萄糖甙的結(jié)構(gòu)估計本實驗中的析出物和初純物均含有保留時間在4min左右的兩個不可水解的物質(zhì)極可能就是這兩種物質(zhì)。

3 結(jié) 論

3.1 依據(jù)色譜分析可以確定蘆葦葉中含有蘆丁、野黃芩苷、橙皮苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、山奈酚、異鼠李素(或橙皮素)、異甘草素和黃芩素。其中野黃芩苷、橙皮苷、芹菜素、山奈酚、異甘草素和黃芩素在其他文獻中尚未見報道。析出物比初純物的組成復(fù)雜，但二者均含有蘆丁、野黃芩苷、橙皮苷以及保留時間短于4min且不可水解的類黃酮苷。

3.2 蘆葦葉類黃酮的適宜水解條件為：料液比為1:1(mg/mL)，溶劑為甲醇-鹽酸溶液(8:2，V/V)，酸濃度為1.4mol/L，溫度為90℃(析出物)和80℃(初純物)，時間為4 h。該水解條件下，蘆丁、野黃芩苷、橙皮苷可以水解，水解后的樣品中木犀草素、槲皮素、芹菜素和山奈酚含量增加。

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HPLC Analysis of Flavonoids from Reed Leaves

SUN Li-fang，LIU Lin-wei*，Jun-li，LI Xuan
(College of Food Science and Technology, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

Objective: To analyze the compositions of flavonoids from reed leaves. Methods: The crude extract was prepared during the condensation of reed leaf extract. The primarily purified flavonoids were prepared by macro-porous resin. The hydrolysis conditions of flavonoids were optimized. Two samples were hydrolyzed to obtain two hydrolysis products.The compositions of flavonoids were determined by HPLC. Results: The contents of total flavonoids in crude extract and primary purified flavonoids samples were 57.1% and 18.5%, respectively. The optimal hydrolysis conditions for reed leaf flavonoids were hydrolysis temperature of 80－90 ℃, HCl concentration of 1.4 mol/L and hydrolysis time of 4 h. Totally 33 components were separated by HPLC from the crude extract and 8 components were identified based on their retention time. A total of 22 components were separated by HPLC from the primarily purified sample and 5 components were identified. A total of 28 components were separated from the hydrolysates and 7 components were identified. Similarly,25 components were separated from the hydrolyzed primarily purified samples and 7 components were identified.Conclusion: Reed leaves contained rutin, scutellarin, hesperidin, luteolin, quercetin, apigenin, kaempferol, isorhamnetin or hesperetin, isoliquiritigenin, baicalein, and other unknown flavonoids. The content of apigenin among these components was the highest.

reed leaf；flavonoids；hydrolysis；HPLC

O657.7

A

1002-6630(2011)10-0241-05

2010-07-23

孫麗芳(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)。E-mail：slf13389207701@163.com

*通信作者：劉鄰渭(1953—)，男，教授，博士，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：linweiliu8@hotmail.com