固相萃取-流動注射化學(xué)發(fā)光法測定奶粉中的三聚氰胺

高向陽，郝 梅，朱盈蕊

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

固相萃取-流動注射化學(xué)發(fā)光法測定奶粉中的三聚氰胺

高向陽，郝 梅，朱盈蕊

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

建立一種快速測定奶粉中三聚氰胺的新方法，利用魯米諾-高錳酸鉀化學(xué)發(fā)光體系，結(jié)合流動注射技術(shù)，對樣品中的微量三聚氰胺進(jìn)行測定。結(jié)果表明：三聚氰胺對魯米諾-高錳酸鉀化學(xué)發(fā)光體系具有顯著的抑制作用，在最佳實驗條件下，方法的線性范圍為1×10-11～1×10-6mol/L，檢出限(3RSN)為4.0×10-8mg/L，RSD為1.1%(n=11)，樣品加標(biāo)回收率為96.1%～102.2%，用于奶粉中三聚氰胺含量的測定，結(jié)果令人滿意。

三聚氰胺；流動注射-化學(xué)發(fā)光；魯米諾；高錳酸鉀；奶粉

三聚氰胺，簡稱三胺，又稱氰脲三酰胺、三聚氰酰胺、蜜胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，化學(xué)名稱為2,4,6-三胺基-1,3,5-三嗪(2,4,6-triamino-1,3,5-triazine)或1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺(1,3,5-triazine-2,4,6-triamino)，分子式C3H6N8，相對分子質(zhì)量126.12[1]。三聚氰胺是重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，主要用途是與醛縮合，生產(chǎn)塑料。三聚氰胺本身毒性較小，長期或反復(fù)攝入可能對腎和膀胱產(chǎn)生影響，導(dǎo)致結(jié)石產(chǎn)生[2]。但由于其含氮量高，又無氣味和味道，常被不法商人用于冒充食品中的蛋白質(zhì)。鑒于三聚氰胺的人為添加會對消費者造成危害，我國有關(guān)部門已發(fā)布了三聚氰胺限量值的公告[3-4]。

三聚氰胺的檢測方法主要有高效液相色譜法[5-9]、液相-質(zhì)譜法[10-12]、酶聯(lián)免疫法[13-14]、毛細(xì)管電泳法[15-18]、氣相色譜法[19]、熒光光度法[20]等，這些方法所用儀器昂貴、成本較高且操作繁雜，不利于普及應(yīng)用。用流動注射化學(xué)發(fā)光法測定食品中三聚氰胺的研究尚未見報道。本實驗利用三聚氰胺對魯米諾-高錳酸鉀體系發(fā)光強度的抑制作用，建立流動注射-化學(xué)發(fā)光快速測定三聚氰胺的新方法，旨在為奶粉中微量三聚氰胺的測定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

超市市售的5種不同品牌的奶粉。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥99%) 上海安譜公司；魯米諾 蘇州工業(yè)園區(qū)亞科化學(xué)試劑有限公司；高錳酸鉀天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；三氯乙酸 如皋市化學(xué)試劑廠；甲醇(色譜純) 中國上海陸忠制劑廠；乙腈(色譜純) 天津賽孚瑞科技有限公司；氨水 煙臺市雙雙化工有限公司。其他試劑均為分析純。

8×10-3mol/L三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取105℃烘干的三聚氰胺100mg，用重蒸水定容至100mL棕色容量瓶中，4℃冰箱保存，用時逐級稀釋至所需質(zhì)量濃度；1g/100mL三氯乙酸溶液；體積分?jǐn)?shù)5%氨化甲醇溶液；0.1mol/L高錳酸鉀溶液；5.0×10-2mol/L魯米諾儲備液：準(zhǔn)確稱取魯米諾2.2140g，用0.1mol/L的氫氧化鈉溶解并定容于250mL棕色容量瓶中，混勻避光保存兩周后使用。

1.2 儀器與設(shè)備

IFFL-D流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀 西安瑞邁電子科技有限公司；SYZ-B型石英亞沸高純水蒸餾器 江蘇宜興市勤華石英玻璃儀器廠；PXSJ-216 型離子分析儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-5-A型低速臺式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；固相萃取裝置 上海西域有限公司；HY-5回旋式振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；氮吹儀 美國Organomation公司；所有玻璃器皿用5%的硝酸浸泡5h以上，用重蒸水洗凈后投入使用。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在設(shè)定工作條件下，不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液用0.01～1mol/L的鹽酸溶液調(diào)至pH2.50后，用pH2.50的鹽酸溶液定容為50.00mL，混勻，與6×10-4mol/L魯米諾溶液(pH12.50)及1×10-5mol/L高錳酸鉀溶液依次進(jìn)機(jī)測定其發(fā)光值，根據(jù)相對化學(xué)發(fā)光值與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，三聚氰胺濃度在1×10-11～1×10-6mol/L(1.26×10-6～0.126mg/L)范圍內(nèi)，濃度的負(fù)對數(shù)(－lgC)與相對化學(xué)發(fā)光強度呈良好的線性關(guān)系，y=538.5x＋56.259，r＝0.9991。

1.3.2 樣品的處理、固相萃取和測定

稱取2g(精確至0.0001g)乳粉試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入15mL 1g/100mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超聲提取10min后，以4000r/min離心10min。上清液經(jīng)1g/100mL三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后，用1g/100mL三氯乙酸溶液定容至25.00mL，移取5.00mL濾液，加入5.00mL水混勻后做待凈化液。用3mL甲醇、3mL水活化陽離子交換固相萃取柱，移取3.00mL待凈化液至固相萃取柱中，用3mL水和3mL甲醇淋洗，棄去淋洗液并將小柱抽至近干后，用6mL 體積分?jǐn)?shù)5%氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液。固相萃取過程流速不超過1mL/min，洗脫液于50℃用氮氣吹干，殘留物用熱重蒸水溶解，并調(diào)pH2.50，冷至室溫后定容于50mL容量瓶，此為樣品待測液。在與繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的相同條件下測定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測液的濃度CRE/(mol/L)，按下式計算樣品中三聚氰胺的含量ω/(mg/kg)。

式中：m為樣品稱取量/g；126.12為三聚氰胺的基本計算單元/(g/mol)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定條件的選擇

2.1.1 化學(xué)發(fā)光儀工作參數(shù)的設(shè)定

在光電倍增管負(fù)高壓400V、增益1的條件下，對儀器工作參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，實驗表明：儀器在表1參數(shù)下運行，發(fā)光信號穩(wěn)定，且具有最大的信噪比。

表1 化學(xué)發(fā)光儀工作參數(shù)的設(shè)定Table 1 Working parameters of chemiluminescence instrument

2.1.2 魯米諾分析液的pH值和濃度的選擇

實驗選用NaOH、Na2CO3、NaHCO3、Na2CO3-NaHCO3等調(diào)節(jié)魯米諾溶液的堿性，發(fā)現(xiàn)在NaOH溶液中化學(xué)發(fā)光信號較強，故選用NaOH調(diào)節(jié)魯米諾的pH值。實驗在試液pH2.50、高錳酸鉀2×10-5mol/L，魯米諾6×10-4mol/L條件下進(jìn)行。魯米諾的pH值對相對化學(xué)發(fā)光強度的影響如圖1所示，當(dāng)魯米諾pH值為12.50時，發(fā)光信號最強。因此，調(diào)節(jié)魯米諾的pH值為12.50。

圖1 魯米諾的pH值對相對化學(xué)發(fā)光強度的影響Fig.1 Effect of pH on relative chemiluminescence intensity

在魯米諾pH12.50，試液pH2.50，高錳酸鉀濃度2×10-5mol/L的條件下，魯米諾濃度對相對化學(xué)發(fā)光強度的影響見圖2。

圖2 魯米諾濃度對相對化學(xué)發(fā)光強度的影響Fig.2 Effect of luminol concentration on relative chemiluminescence intensity

由圖2可知，魯米諾濃度6×10-4mol/L 時測定的靈敏度較高，相對化學(xué)發(fā)光強度較為理想，選擇此濃度進(jìn)行測定。

2.1.3 高錳酸鉀濃度的選擇

圖3 高錳酸鉀濃度對相對化學(xué)發(fā)光強度的影響Fig.3 Effect of potassium permanganate concentration on relative chemiluminescence intensity

按表1工作參數(shù)，在試液pH2.50、6×10-4mol/L魯米諾pH12.50條件下，高錳酸鉀濃度對相對發(fā)光強度的影響見圖3。由于體系的相對發(fā)光強度隨高錳酸鉀溶液濃度的增大而線性增強，綜合考慮，實驗選擇高錳酸鉀溶液的濃度為1×10-5mol/L。

2.1.4 三聚氰胺溶液最佳pH值的確定

三聚氰胺分析液的pH值是影響化學(xué)發(fā)光強度的重要因素。固定魯米諾溶液的pH12.50、濃度6×10-4mol/L，高錳酸鉀濃度1×10-5mol/L，三聚氰胺試液濃度1×10-6mol/L時，用0.01～1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)三聚氰胺試液的pH值。結(jié)果表明，三聚氰胺溶液對體系的抑制作用隨pH值的減小而增大，但當(dāng)溶液pH值小于2時，發(fā)光信號不穩(wěn)定，故選擇三聚氰胺分析液的最佳pH值為2.50。

2.2 檢出限、精密度和定量限

對1×10-6mol/L三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測定11次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%；以3倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差計算的檢出限為4.0×10-8mg/L(n=11)，工作曲線測定的定量限為1.05×10-4mg/kg，優(yōu)于已有文獻(xiàn)[5,21]的報道。

2.3 干擾實驗

在最佳實驗條件下，研究了樣品中可能的共存物對三聚氰胺測定的影響。實驗結(jié)果表明，對1×10-6mol/L的三聚氰胺，允許誤差為±5%時，100倍的K+、Na+、Zn2+、NH4+、Cl-、SO42-；20倍的淀粉、葡萄糖、乳糖；10倍的Cu2+、Mg2+；5倍的Ca2+不干擾測定。

2.4 樣品測定

由表2可知，所選奶粉樣品中，兩個樣品未檢出，其余3個樣品中三聚氰胺的含量在1.5×10-2～3.9×10-2mg/kg，均未超過規(guī)定限量值[3]，測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均不大于4.6%。

表2 不同乳粉樣品中三聚氰胺含量Table 2 Contents of melamine in different milk powder samplesmg/kg

2.5 回收率實驗

以市售奶粉品牌一為樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，結(jié)果如表3所示。由此可知，樣品測得的回收率在96.1%～102.2%之間。

2.6 提取及凈化條件的選擇

樣品預(yù)處理參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》進(jìn)行[21]，三聚氰胺能夠溶于1g/100mL三氯乙酸和乙腈，二者能夠使乳粉樣品中的蛋白質(zhì)沉淀析出，更有利于后續(xù)凈化和檢測，結(jié)果表明：選用二者為沉淀劑和提取劑效果良好。三聚氰胺呈弱堿性(弱陽離子化合物)，凈化過程一般應(yīng)選擇陽離子交換柱?；旌闲完栯x子交換小柱(PCX柱)通過將磺酸基團(tuán)鍵合在極性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯吸附劑上，具有陽離子交換和反相吸附兩種機(jī)理，能夠有效去除干擾雜質(zhì)，得到滿意的凈化效果，回收率令人滿意。

表3 回收率測定結(jié)果Table 3 Recovery rates for melamine in a certain brand of milk powder

表4 不同方法的參數(shù)比較Table 4 Comparison of different methods to determine melamine

2.7 分析方法比較

將本實驗所得的分析參數(shù)進(jìn)行換算并與文獻(xiàn)中的其他方法進(jìn)行比較，結(jié)果如表4所示。

從表4可以看出，流動注射化學(xué)發(fā)光法的線性范圍寬，精密度好，靈敏度比其他方法高2～4個數(shù)量級。

3 結(jié) 論

基于三聚氰胺對魯米諾與高錳酸鉀之間的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)具有顯著的抑制作用，建立了測定三聚氰胺的流動注射化學(xué)發(fā)光新的分析方法。方法簡單、快速、準(zhǔn)確，分析成本低廉，靈敏度明顯高于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[21]，用于奶粉樣品中三聚氰胺含量的測定，結(jié)果令人滿意。

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Determination of Melamine in Milk Powder by Flow Injection-Chemiluminescence Combined with Solid Phase Extraction

GAO Xiang-yang，HAO Mei，ZHU Ying-rui
(College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to establish a new method to quickly determine melamine in milk powder, a chemiluminescence (FI-CL)system of luminol and potassium permanganate was coupled with flow injection technology. In the method, the chemiluminescence (CL) reaction between luminol and potassium permanganate was significantly reduced by melamine. Under the optimal experimental conditions, melamine concentration in the range of 1 × 10-11to 1 × 10-6mol/L was linearly proportional to the depression of CL signals. The detection limit was 4.0 × 10-8mg/L, with a RSD of 1.1% for 11 replicate determinations. The recovery rates for melamine in a certain brand of milk powder were in the range of 96.1% to 102.2%. This method has been successfully applied to the determination of melamine in real milk powder samples.

melamine；flow injection-chemiluminescence；luminol；potassium permanganate；milk powder

O657.39

A

1002-6630(2011)10-0199-04

2010-08-19

河南省重點學(xué)科建設(shè)基金項目(10466-X-082301)

高向陽(1949—)，男，教授，本科，主要從事食品安全分析研究。E-mail：ndgaoxy@163.com