賓天海 胡帆
婦月康膠囊由當(dāng)歸、川芎、益母草、甘草(炙)、桃仁、干姜(炭)、紅花等八味藥組成的復(fù)方制劑,功能主要用于活血、祛瘀、止痛,用于產(chǎn)后惡露不行,少腹疼痛,也可試用于上節(jié)育環(huán)引起的陰道流血,月經(jīng)過多等。本方中當(dāng)歸、川芎、益母草均含阿魏酸成分,阿魏酸為本方中有效成分之一。因此測定本品中阿魏酸的含量,可作為本品質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。為了更好的控制該制劑的質(zhì)量,保證藥品使用安全、有效,本文采用HPLC法測定了阿魏酸的含量及含量均勻度。
LC-10AP型高效液相色譜儀(日本島津公司);SPD-10Avp紫外-可見檢測器;LC-10ATVP7725(i)型手動(dòng)進(jìn)樣器;威瑪龍色譜數(shù)據(jù)工作站;Aglient 8456紫外可見分光光度計(jì);kh-250db型超聲處理器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。
阿魏酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供,批號為:110773-9910;婦月康膠囊(購自A廠,共3批);甲醇為色譜純;其余試劑為分析純,水為超純水。
2.1 色譜條件 色譜條件為:色譜柱為大連依立特 ODS2柱(HyperClone C18,4.6 ×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸溶液(26∶74),流速為1.0 ml/min,檢測波長為320 nm,進(jìn)樣量為5 μl;柱溫為室溫;理論塔板數(shù)按阿魏酸計(jì)算應(yīng)不低于3000。在上述色譜條件下,供試品中阿魏酸能完全分離,對照品與陰性對照品溶液中沒有峰重疊,色譜圖見圖1。
圖1 高效液相色譜色譜圖
2.2 對照品溶液的制備 對照品溶液的制備精密稱取阿魏酸對照品10.0 mg,置25 ml棕色容量瓶中,加甲醇使溶解并稀釋至刻度,搖勻;精密量取1.5 ml,至100 ml棕色容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得(每1 ml含阿魏酸6 μg)(4℃以下避光保存)。
2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物,研細(xì),混勻,取1.5 g,精密稱定,置50 ml棕色容量瓶中,加甲醇至刻度,超聲處理(功率250W,頻率50kHz)30 min,放冷,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
2.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液5 μl,注入液相色譜儀,以上述色譜條件測定,根據(jù)阿魏酸峰面積,以外標(biāo)法計(jì)算供試品中阿魏酸含量。
2.5 線性關(guān)系考察 線性關(guān)系考察 精密量取阿魏酸對照品溶液10 mg,置25 ml棕色容量瓶中,加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成400 μg/ml對照品溶液,備用。分別精密吸取 400 μg/ml阿魏酸對照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml,分別置100 ml棕色容量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,進(jìn)樣測定。以對照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為:Y=14236X-1721.7,相關(guān)系數(shù)r=0.9995。結(jié)果表明:阿魏酸進(jìn)樣濃度在2~12 μg/ml范圍內(nèi),進(jìn)樣濃度與阿魏酸峰面積呈良好線性關(guān)系。
2.6 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取阿魏酸對照品溶液(6.0 μg/ml)和供試品溶液(批號20091101)各5μl,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,測定阿魏酸面積,其RSD為0.42%,表明儀器精密度良好。
2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液(批號:20091101)5 μl,分別于 0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)行測定,其峰面積 RSD 為0.42%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.8 陰性對照試驗(yàn) 按處方比例取處方中缺當(dāng)歸、川芎、益母草的各味藥材,照制法制取缺當(dāng)歸、川芎、益母草陰性樣品。取陰性樣品1.5 g,并按供試品溶液提取方法制成陰性對照溶液,測定,在上述色譜條件下,缺當(dāng)歸、川芎、益母草陰性對照溶液,在阿魏酸色譜峰處無干擾峰出現(xiàn),表明對被測成分無干擾。
2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號供試品(批號20091101)共5份,每份約1.5 g,精密稱定,按樣品測定項(xiàng)下方法進(jìn)行提取,測定,結(jié)果測得平均值145.5μg/粒,RSD%=0.40,表明重復(fù)性良好。
2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已測知含量的供試品(批號20091101,含量:145.5 μg/粒)5 份,每份約 0.75 g,精密稱定,按供試品溶液制備方法處理。并按上述色譜條件依法測定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。
表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果
2.11 樣品中阿魏酸的含量測定 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液3批,按上述色譜條件測定,以外標(biāo)法計(jì)算,結(jié)果見表2。
2.12 樣品中阿魏酸的含量均勻度測定 取樣品3批,按供試品溶液制備方法提取,以上述色譜條件依法(2005年版藥典二部附錄XE)測定阿魏酸含量均勻度,結(jié)果見表2。
表2 樣品含量及含量均勻度測定結(jié)果
3.1 波長的選擇 文獻(xiàn)[1]采用324 nm作為檢測波長;文獻(xiàn)[2]采用312 nm作為檢測波長;對阿魏酸對照品溶液進(jìn)行紫外吸收光譜測定,其吸收峰為316 nm和324 nm,316 nm處的峰面積較大,故選擇316 nm作為本品的檢驗(yàn)波長。
3.2 流動(dòng)相的選擇 阿魏酸為弱酸性化合物,易分離,在流動(dòng)相中加入少酸性物質(zhì)可改善峰形,參考文獻(xiàn)[3]甲醇-1.5%冰醋酸溶液,文獻(xiàn)[4]乙腈-0.1%磷酸溶液,通過比較兩者不同配比下的分離效果,最終確定為甲醇-1%冰醋酸溶液(26∶74),此條件下,從色譜圖形分析看,阿魏酸托尾因子較小,樣品分離效果好,陰性對照無干擾。
3.3 提取時(shí)間的考察 取同一供試品,超聲時(shí)間分別為20,30,40 min,對提取效果進(jìn)行考察,結(jié)果超聲提取30 min時(shí)可提取完全,故實(shí)驗(yàn)中選擇30 min作為提取時(shí)間。
3.4 阿魏酸 阿魏酸是當(dāng)歸水溶液中的有效成分,屬丙烯酸衍生物,見光受熱極易異構(gòu)化而降解,在酸性溶液較為穩(wěn)定,因此在實(shí)驗(yàn)過程中對樣品和對照品采取加酸和棕色量瓶配制定容,做保護(hù)性處理,保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確。
[1] 黃羅生,郭健新,劉梅,等.HPLC測定阿魏酸含量的探討.中成藥,2004,26(2):134-136.
[2] 章澤恒,譚朝陽.HPLC測定婦科十味膠囊中阿魏酸的含量.中國中醫(yī)信息雜志,2006,13(2):40-41.
[3] 鄧向濤,董玉秀.參桂膠囊中阿魏酸含量的測定.河南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,13(2):40-41.
[4] 孫立恩.產(chǎn)婦安合劑中阿魏酸含量測定.海峽藥學(xué),2007,22(128):47-48.