張 莉，陳乃富

(皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安237012)

苔干多酚氧化酶的酶學(xué)特性研究

張 莉，陳乃富

(皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安237012)

研究了苔干(Lactuca sativa var.angustata)多酚氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明:以鄰苯二酚為底物，該酶的最適pH為7.4，最適溫度30℃，70℃以上溫度使酶迅速失活，動(dòng)力學(xué)方程v=518.96［S］/(0.0166+［S］)，VC、異VC鈉、NaHSO3、L－Cys可完全抑制酶活性，飽和NaCl、10%蔗糖、SDS、EDTA－Na2均可顯著抑制酶活性。該酶能催化鄰苯二酚、焦性沒(méi)食子酸氧化，但對(duì)鄰苯二酚的親和力更強(qiáng)。

苔干，多酚氧化酶，提取，純化，酶學(xué)特性

苔干，又名貢菜、響菜、山蜇菜，是安徽渦陽(yáng)、江蘇邳州等地的傳統(tǒng)名優(yōu)特產(chǎn)蔬菜，在分類上屬菊科萵苣屬莖用萵苣(Lactuca sativa var.angustata)［1－2］。苔干的種植加工有悠久的歷史，因其特有的食用價(jià)值，早已馳名中外。苔干經(jīng)刨皮、劃菜成條、晾曬或烘干脫水而制成綠色或淡綠色的干制品。但是苔干無(wú)論是在加工過(guò)程中，還是在貯藏、銷售等環(huán)節(jié)均存在褐變問(wèn)題，影響到產(chǎn)品質(zhì)量及商品價(jià)值。尤其是在加工過(guò)程中如因陰天無(wú)法晾曬或烘干方法不當(dāng)，均可因褐變尤其是酶促褐變，引起嚴(yán)重的產(chǎn)品質(zhì)量問(wèn)題。酶促褐變主要是由多酶氧化酶(Polyphenol oxidase，簡(jiǎn)稱 PPO，EC 1.10.3.1)催化引起的［3－4］。本文對(duì)苔干多酶氧化酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，為科學(xué)控制苔干加工、貯藏、銷售過(guò)程中的酶促褐變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮苔干 采購(gòu)于安徽渦陽(yáng)義門鎮(zhèn)，為秋季苔干，新鮮苔干購(gòu)回時(shí)帶葉整株放入－18℃冰箱中冷凍保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PPO粗酶液提取 取100g去掉葉片的苔干，加入300mL預(yù)冷的0.2mol/LpH6.8檸檬酸－磷酸緩沖液，按文獻(xiàn)［5］方法制備PPO粗酶液。

1.2.2 PPO的Sephadex G－75柱層析純化 將PPO粗酶液用甘油濃縮至約為原體積的1/6，取此濃縮粗酶液2mL上Sephadex G－75凝膠柱(內(nèi)徑1.5cm，柱高50cm)以0.2mol/L pH6.8檸檬酸－磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為0.5mL/min，自動(dòng)部分收集器每5min收集一管。將記錄儀記錄的蛋白質(zhì)峰值附近的5支試管中的洗脫液合并，即為純化的PPO酶液，以此酶液進(jìn)行酶學(xué)特性研究。

1.2.3 PPO的酶學(xué)性質(zhì) PPO的酶活性的定義與測(cè)定、酶促反應(yīng)的吸收光譜特征、酶促反應(yīng)速度曲線、pH等對(duì)PPO活性影響的測(cè)定均參照文獻(xiàn)［5］進(jìn)行。但是所用測(cè)定酶活性的最大波長(zhǎng)為410nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶促反應(yīng)的吸收光譜

圖1所示的是酶促反應(yīng)開(kāi)始后連續(xù)6次可見(jiàn)光范圍內(nèi)的掃描的吸收光譜，6次掃描的總時(shí)間為14min，每次掃描時(shí)間約為2'20″，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 酶促反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜

表1 連續(xù)掃描的λmax值及OD值變化

結(jié)合圖1及表1可知，PPO催化鄰苯二酚反應(yīng)的產(chǎn)物在不同時(shí)間掃描得到的可見(jiàn)光吸收光譜特征相似，均有一個(gè)最大的吸收峰，但每次掃描得到的最大吸收波長(zhǎng)均不相同，而是隨著酶促反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)(隨掃描次數(shù)的增加)，最大吸收波長(zhǎng)λmax在逐漸增大，從第一次掃描的410nm，增加到第六次掃描的444nm。

表1中的OD值1，是用吸收光譜中最大吸收波長(zhǎng)λmax在表中所示的掃描次數(shù)中得到吸光度值;OD值2是固定用410nm波長(zhǎng)在表中所示的掃描次數(shù)中得到的吸光度值;隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值1、OD值2均呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)。這是由于PPO催化鄰苯二酚轉(zhuǎn)變成醌，醌進(jìn)一步聚合，最后生成結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜的黑色素。醌的進(jìn)一步聚合無(wú)需酶的催化能自動(dòng)進(jìn)行。所以隨酶促反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，OD值會(huì)因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化出現(xiàn)減少趨勢(shì)。也正是因?yàn)轷倪M(jìn)一步聚合向黑色素方向轉(zhuǎn)化而使得產(chǎn)物的吸收峰值波長(zhǎng)不斷增大，向長(zhǎng)波方向偏移。

上述酶促反應(yīng)的變化趨勢(shì)與蕨菜PPO催化鄰苯二酚反應(yīng)的變化趨勢(shì)有相似之處［5］。這也說(shuō)明在測(cè)定PPO活性時(shí)，要確定適宜的酶促反應(yīng)時(shí)間，并準(zhǔn)確把握這一反應(yīng)時(shí)間來(lái)測(cè)定OD值是十分重要的。

2.2 PPO的酶促反應(yīng)速度曲線

圖2所示為苔干PPO催化鄰苯二酚反應(yīng)速度曲線。可以清楚地看出，隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，單位時(shí)間內(nèi)的產(chǎn)物生成量一直在減少，即酶促反應(yīng)的速度在逐漸減小。反應(yīng)至140s時(shí)，產(chǎn)物生成量不再增加，反應(yīng)至200s后，產(chǎn)物生成量反而呈略下降趨勢(shì)，這與2.1項(xiàng)所述吸收光譜及吸光度變化的原因相同，也是因?yàn)镻PO催化鄰苯二酚轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物醌后，醌可以進(jìn)一步自動(dòng)聚合向黑色素方向轉(zhuǎn)化，使得吸光度減小。但是60s以內(nèi)的產(chǎn)物生成量與反應(yīng)時(shí)間近似呈線性關(guān)系，基本能反映酶促反應(yīng)的初速度且60s也能滿足實(shí)驗(yàn)操作的需要，所以選用測(cè)定酶促反應(yīng)1min時(shí)的OD值來(lái)表示酶活性的高低。

2.3 pH對(duì)PPO活性的影響

從圖3分析，苔干PPO的最適pH為7.4，這與蕨菜PPO的最適pH相同，與牛蒡PPO的最適pH7.2相近［6］，比蘋果梨PPO最適pH4.6高出近3個(gè)pH單位［7］。pH在4～7范圍內(nèi)，苔干PPO活性變化幅度較小，而在pH7～8范圍內(nèi)的活性變化幅度非常大，說(shuō)明苔干PPO在pH為7～8范圍時(shí)，對(duì)pH的變化非常敏感，很小的pH變動(dòng)，會(huì)引起酶活性發(fā)生很大變化。當(dāng)pH降至7以下時(shí)，PPO活性也減小到最適pH時(shí)活性的25%以下，當(dāng)pH降至4時(shí)，酶活性只相當(dāng)于pH7.4時(shí)活性的11.3%。說(shuō)明對(duì)于苔PPO而言，pH在7以下就可有效抑制其活性，從而減少褐變的發(fā)生。

圖2 PPO 反應(yīng)速度曲線

圖3 PPO活性與pH的關(guān)系

2.4 溫度對(duì)PPO活性的影響

圖4說(shuō)明，苔干PPO的最適溫度為30℃，在15～45℃范圍內(nèi)均表現(xiàn)較高的活性，15～30℃時(shí)隨溫度的升高PPO活性逐漸增大，30℃以上時(shí)的酶活性表現(xiàn)下降趨勢(shì)。圖5所示的為PPO酶液在60、70、80、90、100℃水浴中保溫一定時(shí)間后測(cè)定的活性與室溫放置酶液測(cè)定活性的比值(%)。從圖5可以看出，70℃以上溫度有利于鈍化酶的活性;80℃水浴溫度處理60s，PPO活性只有未處理活性的23.5%;90℃處理60s、100℃處理30s，PPO活性均降至20%以下; 90℃以上溫度處理120s后，PPO活性基本消失。說(shuō)明采用短時(shí)高溫的熱處理方法是一種有效的鈍化苔干PPO活性的方法。

圖4 PPO活性與溫度的關(guān)系

2.5 底物濃度對(duì)PPO活性的影響

圖5 PPO的熱穩(wěn)定性

相關(guān)系數(shù)r=0.9940，如圖6所示。從圖6中可以得出，Vmax=518.96u，Km=1.66×10－2mol/L。苔干PPO以鄰苯二酚為底物的動(dòng)力學(xué)方程為

圖6 底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的Lineweaver－Burk圖

2.6 抑制劑對(duì)PPO活性的影響

如表2所示抑制劑的抑制效果，其中PPO相對(duì)活性是指各種含抑制劑的酶活性與不含抑制劑的酶活性的比值(%)。由表2分析:VC、異VC鈉、NaHSO3、L－Cys在0.1%～1%濃度范圍對(duì)PPO皆表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，而且隨濃度增大抑制效果增強(qiáng)，直至完全抑制。其中VC、異VC鈉一方面能抑制PPO酶本身的催化作用，同時(shí)又能還原PPO形成的產(chǎn)物醌為酚，并且還消耗反應(yīng)體系中的氧。NaHSO3與L－Cys能與醌類形成無(wú)色聚合物又能還原醌，因此，它們都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用。飽和NaCl也能較強(qiáng)地抑制酶活性。10%蔗糖和一定濃度的SDS也表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用，這與它們對(duì)蕨菜PPO的影響不同，二者對(duì)蕨菜PPO有一定激活作用［5］。不同濃度的EDTA－Na2表現(xiàn)出不同的抑制效果，濃度越高抑制作用越強(qiáng)。EDTA－Na2對(duì)PPO活性的影響可能是與酶分子中Cu2+結(jié)合而抑制酶的活性［5，7－8］。苯甲酸鈉隨濃度的增大，也略表現(xiàn)一定的抑制作用，但抑制效果沒(méi)有其它的抑制顯著。綜上分析認(rèn)為，選擇適當(dāng)?shù)囊种苿﹣?lái)抑制PPO活性是控制酶促褐變的一條有效途徑。

2.7 PPO催化不同底物反應(yīng)的結(jié)果分析

表3所示苔干PPO催化鄰苯二酚(0.04mol/L)、焦性沒(méi)食子酸(鄰苯三酚，0.04mol/L)、愈創(chuàng)木酚(0.04mol/L)、L－酪氨酸(飽和濃度)四種底物反應(yīng)的產(chǎn)物吸光度，由于焦性沒(méi)食子酸在堿性條件下可以發(fā)生自氧化，故這里酶促反應(yīng)選用的是pH6.8而不是pH7.4的檸檬酸－磷酸緩沖液。

表2 抑制劑對(duì)PPO活性的影響

表3 PPO催化不同底物的酶活性

以鄰苯二酚為底物的酶活性為100，另外三種底物的酶活性分別與以鄰苯二酚為底物的酶活性相比，得相對(duì)活性(%)，見(jiàn)表3。從表3看出，PPO催化不同底物的活性差異較大，愈創(chuàng)木酚、L－酪氨酸不是其適宜底物，而鄰苯二酚、焦性沒(méi)食子酸則是其適宜底物，但對(duì)鄰苯二酚的親和力更強(qiáng)。這與有關(guān)文獻(xiàn)［5，8－9］報(bào)道相一致。

3 結(jié)論

3.1 苔干多酚氧化酶催化鄰苯二酚生成的產(chǎn)物在410nm處有最大吸收峰，但隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，最大吸收峰有向長(zhǎng)波偏移的趨勢(shì)。測(cè)定酶促反應(yīng)1min時(shí)的速度能基本反映酶促反應(yīng)的初速度。

3.2 pH對(duì)酶活性影響顯著，酶的最適pH為7.4，調(diào)pH至偏酸環(huán)境可有效地抑制PPO活性。

3.3 反應(yīng)體系溫度在15～45℃范圍內(nèi)酶活性較高，最適溫度為30℃。酶的熱穩(wěn)定性差，70℃以上短時(shí)高溫可有效鈍化酶活性。

3.4 以鄰苯二酚為底物的PPO動(dòng)力學(xué)方程為:v= 518.96［S］/(0.0166+［S］)。

3.5 酶的適宜底物為鄰苯二酚(二元酚)及焦性沒(méi)食子酸(三元酚)。VC、異VC鈉、NaHSO3、L－Cys對(duì)酶都有極強(qiáng)的抑制作用;飽和NaCl、10%蔗糖、SDS、EDTA－Na2也有顯著抑制效果;苯甲酸鈉抑制效果較差。

［1］安徽省科學(xué)技術(shù)廳.安徽植物志［M］.第四卷.合肥:安徽科技出版社，1991:635－636.

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［3］張國(guó)珍.食品生物化學(xué)［M］.北京:農(nóng)業(yè)出版社，1992: 303－308.

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Enzymologic properties of polyphenol oxidase of Lactuca sativa var.angustata

ZHANG Li，CHEN Nai－fu
(Department of Biological and Pharmaceutical，West Anhui University，Liu’an 237012，China)

The kinetic property of polyphenol oxidase(PPO)in Lactuca sativa var.angustata was analyzed.The result showed that，by using the catechol as the substrate，the most suitable pH and temperature for this enzyme was at 7.4 and 30℃，respectively，and it would be rapid inactivated if the temperature went above 70℃.The kinetic equation was v=518.96［S］/(0.0166+［S］)，and VC，sodium D－isoascorbate，NaHSO3，L－Cys could completely inhibit PPO activity.Saturated NaCl，sugar(10%)，SDS and EDTA－Na2could remarkably inhibite PPO activity.This enzyme could catalyze the oxidization of catechol and pyrogallic acid，and had higher affinity to catechol.

Lactuca sativa var.angustata;polyphenol oxidase(PPO);extraction;purifying;kinetic property

TS255.1

A

1002－0306(2011)12－0200－04

2011－08－31

張莉(1973－)，女，碩士，副教授，研究方向:天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)利用。