祝 賀,崔滿華,杜珍武,張 勇,鄒穎剛

(吉林大學(xué)1.第二醫(yī)院婦產(chǎn)科吉林長(zhǎng)春130041;2.中日聯(lián)誼醫(yī)院中心研究室;3.白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理教研室)

隨著分子生物學(xué)和基因技術(shù)的發(fā)展,基因治療為卵巢癌患者帶來(lái)了希望,而基因靶向治療成為當(dāng)今卵巢癌基因治療的新熱點(diǎn)。卵巢特異啟動(dòng)子-1(Ovarian-specific promoter,OSP-1)在卵巢癌中的特異表達(dá)已得到證實(shí)[1]。白細(xì)胞介素-24(Interleukin-24,IL-24)是一種新型的細(xì)胞因子,既能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,又能參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng),是一個(gè)理想的治療功能基因。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建OSP-1調(diào)控下的IL-24基因表達(dá)載體,為探討IL-24靶向基因治療卵巢癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

OSP-1基因啟動(dòng)子片段由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成并克隆入 PUC57質(zhì)粒,pcDNA3.0真核質(zhì)粒載體由吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院中心研究室惠贈(zèng);DH-5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2 主要試劑

TaqDNA酶、T4DNA 連接酶、dNTP、PMD-18T載體試劑盒、DNA Marker及各種限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒小量抽提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自杭州維特潔生化技術(shù)有限公司。

1.3 IL-24基因擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)Genbank中發(fā)表的 IL-24基因cDNA序列(NM-006850.2),利用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物 ,上游引物:5’-GGA TCC GCC ACC ATG AAT TTTCAA CAGAGC-3’,下游引物:5’-CTC GAG TCA GAGCTTGTA GAA TTTC-3’,擴(kuò)增的IL-24片段長(zhǎng)度為639 bp。上游引物5’端添加BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)、Kozak序列及ATG起始密碼子;下游引物5’端添加XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

1.4 IL-24基因克隆

取新鮮的人外周血5 ml,應(yīng)用淋巴細(xì)胞分層液進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞分離,刀豆蛋白刺激72 h后,提取全細(xì)胞mRNA,逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA。以cDNA為模板,應(yīng)用設(shè)計(jì)的IL-24基因擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為58℃退火30 s,循環(huán)35次。產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳并觀察結(jié)果。IL-24基因PCR產(chǎn)物應(yīng)用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。回收后與PMD-18T質(zhì)粒載體連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌,調(diào)取陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒,應(yīng)用BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序鑒定。構(gòu)建的載體命名為PMD-18T-IL-24。

1.5 OSP-1基因啟動(dòng)子調(diào)控基因表達(dá)的真核表達(dá)載體的構(gòu)建

將含有OSP-1基因啟動(dòng)子片段的PUC57質(zhì)粒與pcDNA3.0載體應(yīng)用MluⅠ和 HindⅢ進(jìn)行雙酶切,酶切獲得的OSP-1基因啟動(dòng)子片段與pcDNA3.0載體片段應(yīng)用DNA凝膠試劑盒回收。T4DNA連接酶連接回收產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)大腸桿菌,篩選陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒,應(yīng)用MluⅠ和 HindⅢ進(jìn)行酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序鑒定。構(gòu)建的載體命名為pcDNA3.0-OSP-1。

1.6 OSP-1基因啟動(dòng)子調(diào)控IL-24基因表達(dá)載體的構(gòu)建

將pcDNA3.0-OSP-1載體質(zhì)粒與PMD-18T-IL-24載體應(yīng)用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切,酶切獲得的IL-24與pcDNA3.0-OSP-1載體片段應(yīng)用DNA凝膠試劑盒進(jìn)行回收。T4DNA連接酶連接回收產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化DH-5α感受態(tài)大腸桿菌,篩選陽(yáng)性克隆,質(zhì)粒小量抽提取試劑盒提取質(zhì)粒,應(yīng)用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切鑒定。構(gòu)建的載體命名為pcDNA3.0-OSP-1-IL-24。

2 結(jié)果

2.1 IL-24基因cDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,在639 bp處可見特異性擴(kuò)增條帶,與IL-24基因cDNA大小一致(639 bp),見圖 1。

2.2 PMD-18T-IL-24載體酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果

PMD-18T-IL-24載體酶切后瓊脂糖凝膠電泳可見在639 bp左右有一條帶,與 IL-24基因片段大小一致,見圖2。將此質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明IL-24成功克隆入T載體。

2.3 重組質(zhì)粒pcDNA3.0-OSP-1的酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果

質(zhì)粒pcDNA3.0、pcDNA3.0-OSP-1分別經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后,瓊脂糖凝膠電泳可見在466 bp左右有一條帶,與OSP1基因啟動(dòng)子片段大小一致,在670 bp左右有一條帶,與CMV啟動(dòng)子與增強(qiáng)子片段大小一致,見圖3。將重組質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè),結(jié)果表明OSP-1基因啟動(dòng)子片段成功克隆入pcDNA3.0中并替換CMV啟動(dòng)子與增強(qiáng)子片段,OSP-1基因啟動(dòng)子調(diào)控基因表達(dá)的真核表達(dá)載體的構(gòu)建成功。

2.4 重組質(zhì)粒pcDNA3.0-OSP-1-IL-24的酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pcDNA3.0-OSP-1-IL-24經(jīng)BamHI和Xho I雙酶切后,瓊脂糖凝膠電泳可見在639 bp左右有一條帶,與 IL-24基因片段大小一致,見圖4。表明IL-24基因成功克隆入pcDNA3.0-OSP-1中,OSP-1基因啟動(dòng)子調(diào)控IL-24基因表達(dá)的真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3 討論

腫瘤基因治療時(shí),外源基因可非特異性轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá),引起一系列毒性反應(yīng),嚴(yán)重限制了其在臨床上的應(yīng)用。如何提高其靶向性成為近年研究新熱點(diǎn),目前主要集中于對(duì)特異啟動(dòng)子及靶向基因的研究。OSP-1是Selvakumaran等[1]從小鼠卵巢中提取的卵巢特異啟動(dòng)子,它可以激活正常卵巢細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞的基因表達(dá),體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)OSP-1能有效促進(jìn)卵巢起源的上皮細(xì)胞系基因的表達(dá)。Bao等[2]應(yīng)用OSP-1調(diào)控 HSV-tk基因,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示能該系統(tǒng)使自殺基因在卵巢腫瘤細(xì)胞中選擇性地表達(dá),具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性。

有了特異的啟動(dòng)子,我們還需要一個(gè)理想的外源基因。IL-24又稱黑色素瘤分化相關(guān)基因-7(melanoma differentiation associated gene-7,MDA-7),是Jiang[3]等于1995年利用差式雜交技術(shù)在黑色素瘤細(xì)胞株HO-1中分離的,屬于IL-10家族成員。其主要閱讀框架編碼一種由206個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),分子量為23.8KD。主要在脾、胸腺、外周血白細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫組織和分化的黑色素細(xì)胞中表達(dá),是一種重要的免疫因子,有抗腫瘤免疫功能。Sarkar等[4]研究證明 IL-24通過復(fù)制缺陷型腺病毒為載體的MDA-7基因(Ad-mda-7)介入不同的人類腫瘤細(xì)胞可引起這些腫瘤細(xì)胞的凋亡,而對(duì)正常的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞沒有毒副作用。Su等[5]發(fā)現(xiàn)IL-24可產(chǎn)生抗腫瘤-旁觀者效應(yīng),這種能力使mda-7/IL-24不僅能直接治療腫瘤局部,而且對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病灶也可能起效。

圖1 IL-24基因PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 PMD-18T-IL-24載體酶切1%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 pcDNA3.0-OSP-1的酶切1%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖4 pcDNA3.0-OSP-1-IL-24的酶切1%瓊脂糖凝膠電泳圖

IL-24是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤-旁觀者效應(yīng)及刺激免疫系統(tǒng)應(yīng)答三者協(xié)調(diào)作用的方式來(lái)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。mda-7/IL-24良好的選擇性抗腫瘤能力使其成為一種十分理想的抗癌基因藥物。如何鞏固及加強(qiáng)它的抗腫瘤能力以及聯(lián)合其它常規(guī)腫瘤治療手段來(lái)增強(qiáng)其臨床效能,將持續(xù)成為研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)有許多研究發(fā)現(xiàn),有一些方法或制劑能增強(qiáng)mda-7/IL-24的抗腫瘤能力,包括:聯(lián)合放療、化學(xué)制劑和藥物、單克隆抗體、基因聯(lián)合和靶向基因運(yùn)送等。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及 GenBank中OSP-1和IL-24基因序列查詢結(jié)果,化學(xué)合成了OSP-1啟動(dòng)子片段及IL-24的擴(kuò)增引物,并加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。通過PCR方法從人外周血基因組中釣取了IL-24基因。以pcDNA3載體為骨架,將OSP-1啟動(dòng)子片段克隆入pcDNA3.0中并替換CMV啟動(dòng)子,使該載體具有靶向卵巢癌細(xì)胞表達(dá)的能力。在此基礎(chǔ)上,又將IL-24基因克隆入pcDNA3.0-OSP-1中,成功構(gòu)建了卵巢特異啟動(dòng)子OSP-1調(diào)控下的腫瘤特異性靶向基因 IL-24的真核表達(dá)載體pcDNA3.0-OSP-1-IL-24。該載體體現(xiàn)了基因治療主動(dòng)靶向和被動(dòng)靶向的結(jié)合,為加強(qiáng)IL-24特異性抗腫瘤能力及實(shí)現(xiàn)卵巢癌基因治療的針對(duì)性和安全性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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