李豐伯,程 遙,胡 凱,董曉娟,方樂金

（1.黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,安徽黃山245021;2.黃山市科技局,安徽黃山 245021）

環(huán)鏈擬青霉固體培養(yǎng)基優(yōu)化的研究

李豐伯1,程 遙2,胡 凱1,董曉娟1,方樂金1

（1.黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,安徽黃山245021;2.黃山市科技局,安徽黃山 245021）

本文通過固體培養(yǎng)環(huán)鏈擬青霉環(huán)鏈實(shí)驗(yàn)得出:添加了三種土樣及啤酒糟、谷殼、鋸末的固體培養(yǎng)基具有不同的產(chǎn)孢子和菌絲生長效果。篩選出三個(gè)最佳配方,從添加的三類土樣后的固體培養(yǎng)基產(chǎn)孢子效果上來看,塘泥土>菜園土>污泥土。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)方法模擬了野外環(huán)境,在降低本菌株大規(guī)模培養(yǎng)的生產(chǎn)成本,便于推廣應(yīng)用和進(jìn)一步的研究開發(fā)的方向上做了部分探討。

環(huán)鏈擬青霉;固體培養(yǎng)

環(huán)鏈擬青霉[Paecilomycescateniannulatus]是一種重要的昆蟲病原真菌,主要用于溫室害蟲生物防治。環(huán)鏈擬青霉對(duì)蚜蟲和菜青蟲有較好的防治效果[1]。其孢子的萌發(fā)溫度在35℃以下,對(duì)溫血?jiǎng)游锾貏e是哺乳動(dòng)物較為安全,國內(nèi)外對(duì)環(huán)鏈擬青霉的生物學(xué)、分類、生化和應(yīng)用的研究很少[2]。本研究進(jìn)行了該菌的固體發(fā)酵優(yōu)化的研究,了解利用食品、農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物固體培養(yǎng)的特性,以期將該菌研發(fā)為有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)微生物殺蟲劑。

以工業(yè)化大生產(chǎn)為目的的實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn),原材料的成本問題不能被忽視,而單純以玉米渣、小米、麥麩為原料的三級(jí)固體培養(yǎng),成本高、產(chǎn)孢量低,而且造成大量原料的浪費(fèi)[3]。特別是,微生物殺蟲劑存在著培養(yǎng)周期長,見效較慢,受環(huán)境影響較大,農(nóng)民受科學(xué)文化素質(zhì)較低的影響,推廣較為困難等方面的制約。為此本著就地取材,適應(yīng)安徽本地實(shí)際,經(jīng)濟(jì)實(shí)用的出發(fā)點(diǎn),農(nóng)民易于操作,原材料來源廣配方的思路,按不同比例進(jìn)行三級(jí)固體培養(yǎng)料的配方試驗(yàn)方式,篩選出合理培養(yǎng)料配合比例,盡量使用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物,降低生產(chǎn)成本。

在目前的機(jī)械農(nóng)業(yè)、白色農(nóng)業(yè)中害蟲猖獗,害蟲益蟲的比例嚴(yán)重失調(diào)的大環(huán)境下,本課題研究的生物防治菌環(huán)鏈擬青霉具有生長速度較快,抑制其他雜菌的生長,對(duì)蚜蟲、菜青蟲、白粉虱等害蟲的致病性較高的優(yōu)勢,故使用此菌進(jìn)行以菌治蟲的生物防治,不僅可以降低農(nóng)作物生產(chǎn)成本,提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的市場競爭力,降低農(nóng)作物殘留毒性,還可以改善環(huán)境,維護(hù)生態(tài)平衡。故此菌有較好的應(yīng)用前景,有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

環(huán)鏈擬青霉[Paecilomycescateniannulatus]x-1,采自云南西雙版納勐臘西山,保藏于黃山學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

一級(jí)斜面菌種培養(yǎng)基:PSA培養(yǎng)基。

二級(jí)液體搖瓶培養(yǎng)基:啤酒糟5%,蔗糖1%,豆餅粉0.5%,磷酸二氫鉀0.02%,豆油0.05%,硫酸鎂0.02%,尿素0.1%。

三級(jí)固體培養(yǎng)料按不同比例配置而成（表1）,固體培養(yǎng)料分為4類。

第1類（ABCD）以谷殼和啤酒糟加三種土配方

第2類（EFGH）以啤酒糟、谷殼和鋸末加三種土配方

第3類（IJKL）以豆渣粉、谷殼加三種土配方

第4類（MNO）以谷殼加三種土配方

李順過來說，六如叔，你怎么這么擰呢，社區(qū)開發(fā)那是鄉(xiāng)里開會(huì)訂下的，你那個(gè)合同也不頂事。再說，還是人家佟老板救了你，你總不能恩將仇報(bào)吧。

1.2 方法

1.2.1 一級(jí)斜面菌種培養(yǎng)

采用PSA培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)（SEA,1977）[4]

1.2.2 固體培養(yǎng)基配置方法

取回土樣,在恒溫箱中60℃烘干,粉碎,滅菌。按固體培養(yǎng)料配方配好,加水量以用手握住有水滴滲出而松手后又不結(jié)成團(tuán)為好,裝到罐頭瓶中,各瓶裝入量疏松度和高度一致,以便保持相同的供氣量,提高干燥箱溫度至40-45 ℃,烘干 ,取出 ,稱重。[5]

1.2.3 固體料發(fā)酵方法

1.2.4 孢子含量的測定

用1/10000精度電子天平稱取1g菌粉,放入500ml三角瓶中加無菌水100ml,震蕩用玻璃珠10粒,用手搖勻,然后逐步稀釋,用血球計(jì)數(shù)板測定孢子含量。

產(chǎn)孢量=平均每小格孢子數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)

表1 固體培養(yǎng)料配方

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用單因素分組完全隨機(jī)設(shè)計(jì)試驗(yàn),采用LSD測驗(yàn)法做多重比較。

2 結(jié)果與分析

采用最佳液體接種量接種表1所有配方進(jìn)行固體發(fā)酵,產(chǎn)孢量結(jié)果見表2。不同固體配方對(duì)產(chǎn)孢量的影響為以下幾點(diǎn):

（1）第4類配方?jīng)]加啤酒糟或豆渣粉,營養(yǎng)物質(zhì)不足或營養(yǎng)物質(zhì)太單調(diào),沒有足夠的C源、N源或其它微量元素,所以沒有菌絲生長,沒有孢子產(chǎn)生。只見少數(shù)孢子附著在培養(yǎng)料上。

（2）其他配方中第3類菌絲生長最好,培養(yǎng)基被包埋,顏色全部變白,菌絲生長茂密。從整體上來看孢子量是配方1最高,其次是配方3,再次是配方2。

（3）從每一個(gè)配方來看,配方B產(chǎn)孢量最高,其次為A和L。其產(chǎn)孢量分別為 185.4×109,167.1×109,和128.1×109個(gè)。這三個(gè)配方在本次試驗(yàn)中是最優(yōu)配方。可以在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中作為有效配方用于擴(kuò)大再生產(chǎn)。

（4）以三種土的利用情況來看:菌絲生長以污泥為最好,塘泥土其次。但就產(chǎn)孢量來看,以用塘泥土為最好,其次為菜園土,最差為污泥土。

表2 固體配方篩選試驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

（1）在實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作的過程中,在選用最佳配方的基礎(chǔ)上,應(yīng)首先進(jìn)行固體培養(yǎng)基接種量的優(yōu)化,從而達(dá)到與預(yù)期值相仿的最高孢子產(chǎn)量。在固體配方篩選實(shí)驗(yàn)中,由本次試驗(yàn)結(jié)果可以得出配方A,B,L三種配方產(chǎn)孢量最高,但室內(nèi)試驗(yàn)的數(shù)據(jù)應(yīng)該與田間應(yīng)用數(shù)據(jù)的對(duì)比上需要進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)。

（2）通過本次試驗(yàn),在環(huán)鏈擬青霉防治生物固體培養(yǎng)料中首次加入土成分,目的是降低生產(chǎn)成本,擴(kuò)大培養(yǎng)料來源,為菌絲生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。為環(huán)鏈擬青霉生物防治菌的在安徽農(nóng)業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)的普及及其推廣應(yīng)用打下基礎(chǔ),降低農(nóng)民生物防治害蟲所投入的資金。試驗(yàn)結(jié)果可看出在供試土樣中,以生物防治菌的產(chǎn)孢量考慮,塘泥土的效果最好。

[1] 李豐伯,方樂金,郭麗敏.一株對(duì)桃芽有較高毒力的環(huán)鏈擬青霉菌株的固體培養(yǎng)條件的研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)2008,14（23）:47-49.

[2] 劉愛英,梁宗琦,陳月碧.環(huán)鏈擬青霉和玫煙色擬青霉對(duì)菜青蟲的致病條件的研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)1982（1）:57-59.

[3] 王成樹.真菌殺蟲劑劑型的研究現(xiàn)狀（綜述）[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,23（3）:375-380.

[4] SEA原著.張景歐等譯.昆蟲病理學(xué)原理[M].北京:科學(xué)出版社.1977:395-502.

[5] Uziel A Kennet h RG. Influence of commercially derived lipids and a surfactant on t he mode of germination and process of germ tube formation in primary conidia of two species of Erynia subgenus Neopandora[J ] . Mycopat hologia1998 , 144 (3) :153 - 163.

Q93-335

A

1673-1794（2011）02-0036-02

李豐伯（1979-）,男,碩士,講師,從事微生物學(xué)方面研究。

安徽省優(yōu)秀青年人才基金（2009SQRZ168）

2010-11-20