高效液相色譜法測定硫酸小檗堿注射液的含量

李華岑，劉素梅，臧合英，周紅霞，班付國

(河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州 450008)

硫酸小檗堿注射液［1］是目前臨床上較為常用的抗菌藥，主要用于治療腸道細(xì)菌性感染。標(biāo)準(zhǔn)中硫酸小檗堿含量測定方法為滴定法，操作比較繁瑣、費時。在原有研究的基礎(chǔ)上［2］，建立了高效液相色譜法測定硫酸小檗堿注射液含量的新方法。該法操作較簡單，用于測定硫酸小檗堿注射液，結(jié)果準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Waters 2695高效液相色譜儀(帶紫外檢測器);BP211D型電子分析天平(德國賽多利斯公司);鹽酸小檗堿對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號Z220600);硫酸小檗堿(東北制藥總廠，20091017);硫酸小檗堿注射液(河南亞衛(wèi)動物藥業(yè)有限公司，110103，10 mL:0.1 g);乙睛為色譜純;水為高純水;其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱 C18柱(Waters公司，X BridgeTM，4.6 ×150 mm，5.0 μm);流動相為 0.1%磷酸溶液(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.5±0.1)—乙腈(70∶30);流速為1.0 mL/min;檢測波長為229 nm;進樣體積為10 μL。在此色譜條件下，對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1。

1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品10.5mg，置100mL量瓶中，加流動相適量振搖使溶解，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

圖1 色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定 精密量取對照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。另精密稱取硫酸小檗堿原料10.2 mg，置100 mL量瓶中，加流動相適量振搖使溶解，加流動相稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。以流動相為空白，在200～500 nm范圍內(nèi)掃描約10 μg/mL的對照品溶液和硫酸小檗堿溶液的吸收光譜，見圖2。由圖2可知:對照品溶液和硫酸小檗堿溶液的吸收光譜幾乎完全重疊，兩者均在 229、265、347、424 nm 波長附近有最大吸收，其中229 nm附近吸收度最大，為提高測量的靈敏度，實驗選擇229 nm作為檢測波長。

圖2 吸收光譜

2.2 供試品溶液的制備 精密量取硫酸小檗堿注射液1 mL，置100 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系 分別精密吸取對照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，按 1.2.1 項下色譜條件進行測定，以峰面積的積分值對鹽酸小檗堿質(zhì)量進行回歸，線性圖見圖3。鹽酸小檗堿線性范圍為0.2～2.5 μg，回歸方程為 A=4 161 950 m+408 151(相關(guān)系數(shù)r=0.999 9)。說明色譜峰面積的積分值和鹽酸小檗堿質(zhì)量呈良好的線性關(guān)系。

圖3 線性圖

2.4 精密度試驗 精密量取對照品溶液10 μL，連續(xù)6次進樣，鹽酸小檗堿峰面積積分值 RSD為0.2%。精密量取供試品溶液10 μL，連續(xù)6次進樣，硫酸小檗堿峰面積積分值RSD為0.3%。

2.5 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 供試品溶液放置0、1、4、6、12、24 h 后，精密吸取10 μL 進樣，硫酸小檗堿峰面積積分值RSD為1.0%。

2.6 加樣回收試驗 分別取鹽酸小檗堿對照品約8、10、12 mg，精密稱定，置 200 mL 量瓶中，精密量取硫酸小檗堿注射液1 mL，置同一200 mL量瓶中，加流動相50 mL，振搖使溶解，加流動相稀釋至刻度，搖勻。按1.2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積并計算回收率，結(jié)果見表1。由表1可知:鹽酸小檗堿平均加樣回收率為100.8%，RSD為2.2%。

表1 加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

2.7 樣品測定 取2.2項下供試品溶液，按1.2.1項下色譜條件測定峰面積，以外標(biāo)法計算含量，并將計算結(jié)果乘以轉(zhuǎn)換因子1.107。結(jié)果表明:硫酸小檗堿平均含量為10.7 mg/mL，RSD為0.5%(n=5)。比滴定法測定結(jié)果10.4 mg/mL，RSD 為0.7%(n=5)稍有偏高。

2.8 討論 由于目前暫時無法購得硫酸小檗堿對照品，所以本實驗采用鹽酸小檗堿作為對照品對硫酸小檗堿注射液進行含量測定。因為無論硫酸小檗堿還是鹽酸小檗堿其有效成分均為小檗堿，且分子中鹽酸分子和硫酸分子在溶解于溶劑后即和小檗堿分離，溶液中小檗堿以離子態(tài)存在，所以通過測定供試品溶液中鹽酸小檗堿的量再乘以轉(zhuǎn)換因子即可求得硫酸小檗堿的含量。

轉(zhuǎn)化因子的計算方法是基于以下的原理:直接以外標(biāo)法計算所得含量是供試品中鹽酸小檗堿的含量，先將其乘以鹽酸小檗堿分子中小檗堿所占的分?jǐn)?shù)(小檗堿分子量/鹽酸小檗堿分子量)轉(zhuǎn)化為小檗堿的含量，再將其除以硫酸小檗堿分子中小檗堿所占的分?jǐn)?shù)(小檗堿分子量×2/硫酸小檗堿分子量，一個硫酸小檗堿分子中有2個小檗堿分子故分子上需要乘以2)轉(zhuǎn)化為硫酸小檗堿的含量。所以轉(zhuǎn)換因子計算方法為:硫酸小檗堿分子量/(鹽酸小檗堿分子量 ×2)=822.84/(371.82 ×2)≈1.107。

高效液相色譜法測定硫酸小檗堿注射液含量時，由于實驗室鹽酸小檗堿對照品量較少而未對其進行水分測定。對照品標(biāo)簽上無含量，也無使用說明書可查閱，計算時對照品含量未折去水分而按100%計，故可能造成結(jié)果比滴定法偏高。對照品含量的準(zhǔn)確性是提高測量結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。

鹽酸小檗堿溶液和硫酸小檗堿溶液吸收光譜幾乎完全相同，說明溶液的吸收光譜主要是由小檗堿的光學(xué)特性決定的。

［1］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥規(guī)范一九九二年版一部［S］.

［2］李華岑，張閃爍，張躍京，等.高效液相色譜法同時測定諾氟沙星和鹽酸小檗堿的含量［J］.中國獸藥雜志，2011，45(1):14-15.