超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測飼料中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶

李丹妮，張文剛，嚴 鳳，顧 欣

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

可樂定(圖1)和賽庚啶(圖2)都屬合法的人醫(yī)用藥品?？蓸范?Clonidine)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)腎上腺素能α2-受體激動劑，對α2-受體具有特異親和性，屬于咪唑啉衍生物。作為抗高血壓藥物，其藥理作用主要為通過刺激腦干α2-腎上腺素受體導致交感神經(jīng)從中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳出減少，從而降低外周阻力、腎血管阻力、心率以及血壓，也有用于手術后的麻醉和鎮(zhèn)痛［1-2］。賽庚啶為人用抗過敏藥［3］，對抗體內(nèi)組胺對血管、支氣管平滑肌的作用，從而消除過敏癥狀，也可用于改善患者的食欲。

近年開始出現(xiàn)將可樂定用于促進動物生長和改善酮體組成的研究［4-5］，推斷其主要的作用機理為通過促進下丘腦生長腺素神經(jīng)元合成和釋放生長腺素，進而調(diào)節(jié)腺垂體細胞內(nèi)cAMP水平，從而調(diào)控生長激素分泌，促進生豬生長。動物研究表明在豬飼糧中添加0.5 mg/kg可樂定，能顯著提高豬的瘦肉率和眼肌面積，降低脂肪比率和背膘厚，改善豬的胴體組成。賽庚啶是H1受體拮抗劑，屬于抗組胺藥，但同時也是5-羥色胺受體拮抗劑，可在下丘腦食欲中樞拮抗5-羥色胺，這可以解釋賽庚啶具有刺激食欲的功能。目前在國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)將這兩種藥物違法添加在豬飼料中，2010年12月農(nóng)業(yè)部1519號公告已明確把可樂定和賽庚啶列入了《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質(zhì)》清單。

目前已有關于血樣和尿樣中可樂定及賽庚啶檢測方法的報道，主要采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC/MS/MS)［6-8］。國內(nèi)已有采用高效液相色譜法(HPLC)檢測飼料中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶的方法［9-10］。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/MS/MS)技術，建立了飼料中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶的檢測方法，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法通過采集離子碎片及豐度比，能夠更準確進行定性確證，同時大大提高了檢測的靈敏度，為準確定性定量提供了更好的方法。

1 材料和方法

1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀UPLC/Qμattro Premier XE(Waters公司);MassLynx v4.1質(zhì)譜工作站軟件;漩渦振蕩器;CL3R冷凍離心機(美國IEC公司);Laborota 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(德國Heidolph公司)。

1.2 藥品與試劑 鹽酸可樂定對照品，純度≥98%(Sigma公司);鹽酸賽庚啶對照品，純度≥98%(Sigma公司);乙腈色譜純(Merck公司);甲酸，純度96%(TEDIA);甲醇、鹽酸、氨水均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司);實驗用水為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1 液相色譜 色譜柱:SB C18100 mm ×3.0 mm，粒徑1.8 μm(美國 Agilent公司)，柱溫 40 ℃;進樣量5 μL;流速0.3 mL/min;流動相為 A 相:乙腈;B相0.1%甲酸水溶液;梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜參考條件 電噴霧離子源，正離子電離(ESI+);多反應監(jiān)測(MRM);毛細管電壓:3.0 Kv;離子源溫度:110℃;脫溶劑氣流量:700 L/h;錐孔氣:50 L/h;去溶劑溫度:350℃;碰撞氣(Ar)流量0.24 mL/min;碰撞室壓力:3.8 ×10-3Pa。分析中以保留時間和離子對(母離子和兩個子離子)的信息比較進行定性分析;經(jīng)過優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 可樂定和賽庚啶的母離子、子離子及質(zhì)譜參數(shù)

1.3.3 標準曲線 精密稱取鹽酸可樂定對照品，加入適量的水溶解，再用甲醇定容，配成含可樂定濃度約為1 mg/mL的標準貯備液，2～8℃冷藏保存，有效期六個月。賽庚啶貯備液配制:精密稱取鹽酸賽庚啶對照品，用甲醇配成含賽庚啶濃度約為1 mg/mL的標準貯備液，2～8℃冷藏保存，有效期六個月。分別吸取鹽酸可樂定貯備液和鹽酸賽庚啶貯備液適量，置于棕色容量瓶中，用乙腈:0.2%甲酸水溶液(20/80，V/V)稀釋成可樂定和賽庚啶濃度均為 0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 μg/L 的系列對照品工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.4 樣品的前處理 稱取2.00 g試樣于50 mL離心管中，準確加入20 mL鹽酸甲醇提取液(甲醇:0.1 mol/L HCl=80 ∶20)，充分振蕩 20 min，然后于7 000 r/min離心10 min，上清液備用。MCX(3CC/60 mg)固相萃取小柱先用3 mL甲醇，3 mL水活化。取上清液2 mL過柱，用2 mL水和2 mL甲醇淋洗，空氣抽干2 min，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(60℃)至干，用乙腈:0.2%甲酸水溶液(20/80，V/V)1 mL溶解，過0.22 μm濾膜后上機測定。若樣品液中含有的藥物濃度超出線性范圍，進樣前可用一定體積的流動相稀釋，使稀釋后上機液中的藥物濃度在線性范圍內(nèi)。

濃縮飼料及預合混料的濃度水平較高，可根據(jù)實際情況，在提取步驟中增加稀釋步驟后進行凈化。

1.3.5 樣品回收率與精密度 選擇空白配合飼料、濃縮飼料及預混合飼料樣品做為基質(zhì)，在配合飼料中添加可樂定和賽庚啶濃度分別為0.02、0.04、0.1 mg/kg的樣品進行加標回收實驗，前處理步驟按照1.3.4。在預混合飼料和濃縮飼料中添加可樂定和賽庚啶濃度分別為 0.2、0.5、1 mg/kg的樣品進行加標回收實驗，預混合飼料及濃縮飼料在加入提取試劑后，準確移取上清液1 mL到10 mL容量瓶中，加入鹽酸甲醇提取液(甲醇:0.1 mol/L HCl=80∶20)定容至刻度，取稀釋液2 mL過MCX小柱進行凈化，其余步驟與配合飼料一致。每個濃度重復測定6次，計算回收率及相對標準偏差。

1.3.6 檢測限和定量限 取空白樣品，按1.3.4前處理步驟后，經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測得噪音信號的平均值，按信噪比≥3為檢測限，信噪比≥10為定量限。

2 結果

2.1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測定 圖3是可樂定和賽庚啶混合標準溶液的MRM色譜圖。

圖3 可樂定和賽庚啶標準溶液MRM色譜圖(標準工作液濃度為10 ng/mL)

2.2 標準曲線 用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定工作液，獲得標準曲線 A賽庚啶=1 773.74+226.032C，線性相關系數(shù) r=0.999 2，A可樂定=207.371C+23.109 3，線性相關系數(shù) r=0.999 4。

2.3 精密度和回收率 選擇配合飼料、濃縮飼料和預混合飼料空白樣品，按照本方法確定的條件進行加標回收重復性試驗，實驗表明相對標準偏差均≤10%，表明采用本方法測定飼料中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶具有較好的精密度、重復性。統(tǒng)計結果見表3-表5。

表3 配合飼料中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶回收率和精密度

表4 預混合飼料中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶回收率和精密度

表5 濃縮料中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶回收率和精密度

由上表看出，按已確定的樣品提取條件和色譜條件測定添加回收量，實驗表明配合飼料中可樂定和賽庚啶回收率達到70% ～100%，預混合飼料和濃縮飼料中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶回收率達到70% ～110%，相對標準偏差均＜10%，說明該方法對不同種類飼料樣品中，不同含量的鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶的測定均有較好的準確度。圖4-圖9為空白飼料及添加回收率MRM色譜圖。

2.4 檢測限和定量限 飼料樣品中鹽酸可樂定和鹽酸賽庚啶方法最低檢測限為0.01 mg/kg，信噪比S/N(Peak to Peak)＞3。方法最低定量限為0.02 mg/kg，信噪比 S/N(Peak to Peak)＞10。

圖9 濃縮飼料中可樂定和賽庚啶添加回收率MRM圖(添加濃度0.2 mg/kg)

3 討論

3.1 工作液稀釋溶劑的選擇 我們嘗試選擇中性溶劑甲醇、0.2%甲酸、0.2%甲酸∶乙腈 =50 ∶50、0.2%甲酸∶乙腈=20∶80等作為最終進樣前的樣品溶劑進行實驗，發(fā)現(xiàn)溶劑對樣品的影響較大，而且對賽庚啶和可樂定具有不同的效果，當增加溶劑中有機溶劑比例時賽庚啶的溶解性增強，峰面積增大，靈敏度提高，同時可樂定的靈敏度降低。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)進樣溶劑最接近流動相梯度洗脫起始比例時，可使可樂定和賽庚啶的分離度和峰的對稱性符合要求。因此實驗中選擇流動相梯度起始比例的溶劑0.2%甲酸∶乙腈=20∶80作為進樣溶劑。

3.2 SPE柱的選擇 可樂定和賽庚啶均屬于堿性藥物，可選擇對堿性藥物具有高選擇性MCX小柱凈化。同時我們還比較了HLB固相萃取小柱的凈化效率，比MCX小柱略低，因此最終選擇了MCX小柱進行固相萃取凈化。

3.3 流動相的選擇 通過比較三種常見流動相甲醇、甲醇∶水(1 ∶1，V/V)、乙腈:0.2% 甲酸，發(fā)現(xiàn)流動相中未加入0.2%甲酸的情況下，可樂定和賽庚啶的電離效果較差，峰型對稱性差，在加入一定比例的0.2%甲酸后，得到了改善，因此最終選擇乙腈:0.2%甲酸作為流動相。通常因為飼料樣品中基質(zhì)干擾較大，在流動相條件中設置梯度條件可避免樣品中的基質(zhì)干擾，使得定性和定量更加準確。

3.4 色譜柱的選擇 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜相較于普通的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜具有分離速度快、靈敏度高等分離特點，本實驗基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀器進行方法開發(fā)，在方法研制過程中，我們選用了兩款適合超高效液相色譜使用的色譜柱Aglient公司生產(chǎn)的 SB C18100 mm ×3.0 mm，粒徑1.8 μm以及Waters公司生產(chǎn)的BEH C18100 mm×2.1 mm，粒徑1.7 μm 進行比較?？蓸范ㄋ幬飿O性強，不易保留，經(jīng)實驗比較發(fā)現(xiàn)SB C18柱可以提供更好的保留和分離效果，因此最終選擇SB C18色譜柱進行本次檢測方法研究。

3.5 實際樣品檢測 在2010年飼料預警預測工作中，我所利用本方法對采集到的447批次樣品進行了檢測，共檢出25批次陽性樣品，從陽性樣品的分析結果可以看出，目前可樂定和賽庚啶在配合飼料、濃縮飼料和預混合飼料各類型中均存在違法添加的情況。全部陽性樣品中，配合飼料中可樂定的添加范圍為0.1～0.9 mg/kg，賽庚啶的添加范圍為0.2～1.3 mg/kg，濃縮飼料和預混合飼料中可樂定的添加范圍為1.2～1.4 mg/kg，賽庚啶的添加范圍為1.0～19.0 mg/kg。另根據(jù)文獻報道在飼料中添加0.5 mg/kg可樂定時，即能明顯改變豬的胴體組成，因此本方法的定量限和檢測限的均能夠滿足要求。

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