小麥胚芽貯藏過程中的酸敗變質(zhì)機(jī)理

徐 斌 李 波 苗文娟 徐山元 董 英

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，鎮(zhèn)江 212013)

(發(fā)達(dá)面粉集團(tuán)有限公司2，夏津 253216)

小麥胚芽貯藏過程中的酸敗變質(zhì)機(jī)理

徐 斌1李 波1苗文娟1徐山元2董 英1

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，鎮(zhèn)江 212013)

(發(fā)達(dá)面粉集團(tuán)有限公司2，夏津 253216)

小麥胚芽含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白、多不飽和脂肪酸和VE等多種營養(yǎng)素，同時也富含脂肪酶、脂肪氧化酶和酯酶等多種酶類。新鮮小麥胚芽貯藏兩周左右，就會在各種酶和微生物的協(xié)同作用下酸敗變質(zhì)，從而極大限制了小麥胚芽的高效利用。本文系統(tǒng)闡述了小麥胚芽脂肪酶和脂肪氧化酶的種類、酶學(xué)特性及其催化機(jī)制;并從小麥胚芽脂質(zhì)的脂肪酶催化水解、自動氧化、脂肪氧化酶催化氧化以及微生物污染等多角度分析了小麥胚芽貯藏過程中的酸敗變質(zhì)機(jī)理。對小麥胚芽脂肪酶和脂肪氧化酶的深入了解，有助于研發(fā)可靠的小麥胚芽穩(wěn)定化技術(shù)與裝備，為其進(jìn)一步深加工創(chuàng)造條件。

小麥胚芽 脂肪酶 脂肪氧化酶 微生物 酸敗 機(jī)理

小麥胚芽(Wheat Germ)為小麥生長發(fā)育的基礎(chǔ)，富含各種必需氨基酸、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素，被譽(yù)為“人類天然的營養(yǎng)寶庫”，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥與飼料工業(yè)。然而，新鮮小麥胚芽富含多種酶類，如脂肪酶(Lipase，簡稱LA)、脂肪氧化酶(Lipoxygenase，簡稱 LOX)、酯酶、α －淀粉酶和蛋白酶等［1－2］。LA能催化小麥胚芽脂質(zhì)中的三酰甘油水解成高級脂肪酸［3］;LOX催化氧化小麥胚芽脂質(zhì)中的亞油酸，生成氫過氧化油酸，經(jīng)分解生成揮發(fā)性的醛和酮類等［4］。由于LA和LOX等酶的共同作用，使得小麥胚芽貯藏穩(wěn)定性極差。此外，制粉過程中小麥胚芽常會受到微生物污染，微生物代謝產(chǎn)生的酶進(jìn)一步加速了脂質(zhì)水解與氧化進(jìn)程［5－6］。常溫下，新鮮小麥胚芽存放兩個星期左右就會酸敗、變質(zhì)［7］，從而限制了小麥胚芽的高效利用［8］。

1 小麥胚芽脂肪酶

1．1 脂肪酶

脂肪酶(EC3．1．1．3)又稱甘油酯水解酶，它作用于脂質(zhì)分子中的羧酸酯鍵，將三酰甘油水解為脂肪酸和二酰甘油、單酰甘油或甘油，其總體反應(yīng)歷程如圖1所示。LA也可催化甘油酯及水不溶性酯類的醇解、酯化、酯交換以及合成等反應(yīng)［9］。脂肪酶主要來源于微生物、動物和植物，目前已有數(shù)十種商業(yè)化脂肪酶出現(xiàn)［10］，并廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化工、造紙等行業(yè)［11－12］。

LA的催化反應(yīng)不需要輔酶，且反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少［13］，反應(yīng)通常具有高度立體異構(gòu)專一性和化學(xué)選擇性［14－15］。LA另一重要特征是只能在異相系統(tǒng)，即在油－水界面上作用，分解脂肪的能力高度依賴于酶與脂質(zhì)的接觸面積，稱為界面活化現(xiàn)象［16］。

圖1 三酰甘油的脂肪酶催化水解反應(yīng)歷程

1．2 小麥胚芽脂肪酶的種類與特性

谷物來源脂肪酶是植物脂肪酶中研究較多的一類，主要包括小麥、燕麥、大麥、稻谷和玉米脂肪酶等，因小麥?zhǔn)侨蜃钪饕募Z食作物之一，所以小麥脂肪酶是谷物脂肪酶中最受關(guān)注的一種［17－18］。

小麥脂肪酶主要分布在麩皮與胚芽兩個部位，其中前者約占75% ～80%，胚芽中約占20% ～25%。麩皮中LA對熱敏感，而胚芽中LA熱穩(wěn)定性較高。當(dāng)溫度升至75℃時，二者的酶活基本接近［19］。一般而言，小麥在未發(fā)芽或遭破壞時，其LA活力較低，約為2．17 ～9．42 U/g，且較為穩(wěn)定［20］;一旦發(fā)芽，在三酰甘油為底物的情況下其活力會提高數(shù)十倍，但三乙酸酯和甘油酯為底物時并非如此［1］。

1948年，Singer等［21］初步分離了小麥胚芽脂肪酶，并認(rèn)為其是一種酯酶，只對短鏈甘油酯起反應(yīng)，而對于中長鏈的基本無效。1966年，Staufer等［22］發(fā)現(xiàn)在小麥胚芽脂肪酶粗酶中表現(xiàn)解酯酶活性的實(shí)際上有3種酶:脂肪酶、酯酶及三丁酸甘油酯酶。脂肪酶具有明顯的界面活性，該酶可水解三酰甘油，但不能水解乙酯，反應(yīng)符合米氏方程，其對中長鏈脂肪酸，尤其是油酸反應(yīng)效率最高［23］。該酶分子質(zhì)量約(143 ±2)ku，最適溫度37 ℃，熱穩(wěn)定性好，在pH 8．0、60～90°C下保溫1 h能保持80%酶活［24］。另有報(bào)道，小麥胚芽脂肪酶pI值為5．4，其分子質(zhì)量為42 ku，最適 pH 8．0，適宜 pH 7．0 ～9．0，對 pH 敏感，當(dāng)pH 7時酶活下降了50%;最適pH下，當(dāng)有20%果糖，蔗糖等保護(hù)劑存在時，其Tm值約為60℃［25］。當(dāng)pH大于10，酶蛋白的α－螺旋自解旋，導(dǎo)致活性中心部位結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，酶活力喪失;該酶對水分活度具有較高的依賴性，水分活度為0．90時具有較高活力，同時，鈣、鎂離子對其有促進(jìn)作用，鉀、鈉離子則無明顯效果［26］。

酯酶不具有界面活性，能水解乙酯，但不能水解三酰甘油;反應(yīng)不符合米氏方程［25］。該酶適宜pH 6 ～8，最適 pH 7．2 ～7．3，且對 pH 波動不敏感，當(dāng)pH 6時還能保持80%酶活;對熱較穩(wěn)定，最適溫度30℃，當(dāng)溫度升到50℃時，10 min內(nèi)酶活損失50%［22］。

三丁酸甘油酯酶也具有明顯的界面活性，該酶能同時水解三酰甘油和乙酯，反應(yīng)基本符合米氏方程［25］。其對中短鏈脂肪酸，尤其是丁酸和己酸三甘油酯顯示了最高活力;最適 pH 6．6～6．8，適宜pH 5．5 ～7．5，對 pH 敏感，當(dāng) pH 5．5 時，酶活約下降80%;對熱不穩(wěn)定，最適溫度在20℃，當(dāng)溫度上升到25 ℃時，很快就完全失活［22］。

小麥胚芽脂肪酶具有LA的共同結(jié)構(gòu)特征:具有α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu);擁有Gly－X－Ser－X－Gly保守結(jié)構(gòu)域，且Ser為催化三聯(lián)體的一部分;催化中心由Ser－His－Asp三元基團(tuán)組成，被一個具有兩親性的α－螺旋“蓋子”所覆蓋［27］。目前尚無小麥胚芽脂肪酶晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道，Korneeva等［28］研究表明，LA活性中心由天冬氨酸或谷氨酸的羧基與組氨酸的咪唑基構(gòu)成，絲氨酸的羥基在催化中起著關(guān)鍵作用;在苯甲基磺酰氟中培育1 h，其酶活下降70%以上;EDTA是 LA的非競爭抑制劑。另有報(bào)道，Ser174－His293－Asp230為其催化三聯(lián)體，其核心結(jié)構(gòu)與Rhizzomucor Miehei lipase絲狀真菌的LA蛋白序列相似度超過35%［29］。共含350氨基酸，結(jié)構(gòu)含約20%的α－螺旋和40%的β－螺旋折疊，其余均為回環(huán)［25］。小麥胚芽脂肪酶的催化機(jī)制和其他 LA相似，遵循乒乓 bi－bi機(jī)制［3］。

2 小麥胚芽脂肪氧化酶

2．1 脂肪氧化酶

1932年，Andre首次發(fā)現(xiàn)大豆豆腥味的產(chǎn)生是多不飽和脂肪酸的酶促氧化所致，其中關(guān)鍵酶即為脂肪氧化酶(EC1．13．11．12)［30］，系統(tǒng)命名為 Linoleate －Oxygen Oxidoreductase，即亞油酸－氧氧化還原酶，俗稱脂肪氧化酶或脂肪氧合酶［31］。

2．2 小麥胚芽脂肪氧化酶的種類與特性

1943 年，Sumner［32］首次報(bào)道小麥胚芽中存在LOX。1982年，Nicolas等［33］從小麥胚芽中分離獲得3種LOX同工酶(L－1、L－2、L－3)，凝膠過濾色譜測得它們的分子質(zhì)量為90 000～95 000 u，SDSPAGE測得的分子質(zhì)量為110 000 u。L－1比 L－2、L－3熱穩(wěn)定性好，3種同工酶和粗酶具有相同的最適pH范圍6～6．5。

Shiiba等［34］報(bào)道小麥胚芽LOX包含4種同工酶(L－1、L－2、L－3、L－a)，其中 L－3約占總量的50%，L－1、L－2、L－3這3種主要的同工酶最適pH均為5．5，其中 L－2范圍較寬，為4．5～6．0，L －3對亞油酸、亞麻酸均具有較高的活性，而L－1與 L－2對亞麻酸氧化催化能力較弱;L－1、L－2、L－3的SDS－PAGE呈單一條帶，阻滯系數(shù)為0．28;L－1、L－2、L－3具有相似的熱敏性，在45℃具有最高的酶活，而75℃則完全被鈍化。另有報(bào)道，即使在低水分條件下，LOX也表現(xiàn)出較高的活性［35］。

2．3 脂肪氧化酶的催化氧化機(jī)制

LOX主要催化3種不同類型的反應(yīng):(1)脂質(zhì)的雙加氧化反應(yīng)(過氧化物酶反應(yīng));(2)氫過氧化脂質(zhì)的次級轉(zhuǎn)化(氫過氧化物酶反應(yīng))［36］;(3)環(huán)氧白三烯的形成(白三烯合成反應(yīng))［37］。

LOX常見的底物為必需脂肪酸的3種同分異構(gòu)體，亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸［38］，在植物中其底物主要是亞油酸和亞麻酸。亞油酸和亞麻酸上的加氧位置是C9和C13，在花生四烯酸上的加氧位主要是C5、C12和C15，也可在C8、C9和 C11位上加氧。LOX也可以三亞油酸甘油酯、三亞麻酸甘油酯或其他不飽和脂肪酸的類脂作為底物［39］。

LOX在有氧環(huán)境里催化底物起連鎖反應(yīng)形成氫過氧化物。完整的脂質(zhì)酶促氧化包含四步驟:(1)酶激活;(2)有氧途徑;(3)厭氧途徑;(4)非酶途徑。LOX的催化類似于多不飽和脂肪酸自動氧化，所不同的是LOX催化反應(yīng)比自動氧化更快，對反應(yīng)底物有選擇性，且對作用底物的氧化程度不一樣［40］。大豆LOX催化的脂肪酸氧化必須具有順，順－1，4－戊二烯結(jié)構(gòu)、且其甲基終端C8處有一個亞甲基團(tuán)(兩個雙鍵之間的亞甲基)［41］。這類脂肪酸只在C6處發(fā)生氧化，而亞油酸在C6和C10都能發(fā)生氧化反應(yīng)。就亞油酸而言，其主要氧化產(chǎn)物是具旋光性的C9和C13位氫過氧化物的同分異構(gòu)體［42］。在O2和LOX存在的具有順，順－1，4－戊二烯結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸中，LOX中的Fe3+可能參與了電子的遷移，LOX必須以氧化態(tài)存在(Fe3+)，它能催化除去油酸或亞油酸C11亞甲基的氫，形成一個C13自由基，同時LOX轉(zhuǎn)化為還原態(tài)(Fe2+)。在有氧和缺氧條件下，反應(yīng)都能進(jìn)行，產(chǎn)生的氫過氧化物可進(jìn)一步形成其他產(chǎn)物［43］。

Tappel等［44］則認(rèn)為，LOX所催化的亞油酸的氧化不同于亞油酸自動氧化過程，首先是亞油酸、氧和LOX形成復(fù)合體;然后在酶的表面形成一個雙游離基活化體，即一個氫離子和一個電子從亞油酸上轉(zhuǎn)移至氧分子上;雙游離基在酶分子表面結(jié)合形成亞油酸過氧化氫;此過氧化氫物與酶分離并脫落下來，至于亞油酸的哪個不飽和碳原子首先受到O2的進(jìn)攻由LOX特性決定(圖2)。

圖2 LOX催化亞油酸氧化的步驟

3 小麥胚芽貯藏過程中的酸敗變質(zhì)

制粉過程中，當(dāng)胚芽從胚乳中分離出來后，由于受到磨輥擠壓，小麥胚芽中脂質(zhì)接觸到高活性脂肪酶，在其作用下酸敗水解成游離脂肪酸，導(dǎo)致新鮮小麥胚芽的貨架期很短，不再適合人類食用。小麥胚芽脂質(zhì)水解首先是由內(nèi)源酶(LA)催化，如果小麥胚芽中混入了麩皮等雜質(zhì)，微生物代謝的酶也會引起脂質(zhì)水解［5］。小麥胚芽脂質(zhì)水解伴隨多種營養(yǎng)與感官品質(zhì)變化，如肥皂味般的異味、酸度上升、功能特性變化、脂肪酸氧化的易感性增加。而游離脂肪酸會進(jìn)一步的氧化酸敗(LOX)，產(chǎn)生自由基，并通過裂變，最終產(chǎn)生異味，營養(yǎng)價值下降。歸納起來，小麥胚芽酸敗主要有三種類型:即水解酸敗、酶促氧化酸敗和自動氧化酸?。?］，如圖3所示。

圖3 小麥胚芽的變質(zhì)途徑

小麥胚芽中酶系統(tǒng)通常包括 LA、LOX、磷酸酶［45］、過氧化物酶［32］及乙醇脫氫酶［46］等，在它們的聯(lián)合作用下，使小麥胚芽中的多元不飽和脂質(zhì)降解生成小分子的醛、醇等(圖4)。

圖4 從亞油酸和亞麻酸形成揮發(fā)性C6化合物的途徑

3．1 小麥胚芽的酶促水解酸敗

LA催化小麥胚芽油脂水解的一般路徑為:小麥胚芽中的脂肪酶、三丁酸甘油酯酶等及微生物(如霉菌繁殖產(chǎn)生解脂酶)作用于三酰甘油，使之水解為脂肪酸、二酰甘油、單酰甘油和甘油(圖5)。

小麥胚芽脂質(zhì)過氧化物的分解很復(fù)雜，伴隨著小麥胚芽脂質(zhì)過氧化物RO－OH的均裂形成烷氧基自由基(RO·)，再經(jīng)過C－C分離，形成醛、酮、醇、酯、呋喃和內(nèi)酯等分解產(chǎn)物，造成小麥胚芽風(fēng)味地惡化［50］。

3．3 小麥胚芽的酶促氧化變質(zhì)

小麥胚芽中脂質(zhì)酶促氧化酸敗是由LOX參加的氧化反應(yīng)，當(dāng)小麥胚芽組織被破壞或者受傷時，其中的LA和LOX被激活，脂質(zhì)的連續(xù)酶反應(yīng)隨著脂肪酸的釋放而開始(LA)，游離脂肪酸中的多不飽和脂肪酸被LOX催化氧化成脂肪酸氫過氧化物;氫過氧化物經(jīng)過相應(yīng)的裂解酶催化產(chǎn)生醛和醛酸;異構(gòu)酶催化生成環(huán)氧羥基脂肪酸，后者又水解生成三羥基脂肪酸;過氧化物異構(gòu)酶催化產(chǎn)生α－乙烯醇脂肪酸和β－乙烯醇脂肪酸;氫過氧化物經(jīng)環(huán)化酶催化生成12 － 氧 － 植物二烯酸［48，51］。

LOX不僅催化小麥胚芽脂質(zhì)多不飽和脂肪酸(如亞油酸和亞麻酸)中的亞甲基氧化，造成多不飽和脂肪酸的損失，同時LOX也會破壞維生素A，或與一些氨基酸間的相互作用會降低蛋白品質(zhì)［52］，LOX產(chǎn)生的脂肪酸過氧化氫物還能直接與食品中的營養(yǎng)成分如蛋白質(zhì)和氨基酸結(jié)合，這些變化均降低了小麥胚芽的食用和營養(yǎng)價值［53］。

4 結(jié)束語

油脂精煉損失是毛油游離脂肪酸含量的2～3倍，隨著小麥胚芽毛油中游離脂肪酸的含量增加，可食用小麥胚芽油產(chǎn)率將顯著減少。只有游離脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于5%才利于工業(yè)化生產(chǎn)，如果超過10%則很不經(jīng)濟(jì)。新鮮小麥胚芽通常僅含有1．5% ～2%的游離脂肪酸，但在貯藏?cái)?shù)天后，其游離脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升、很快超過5%，因而小麥胚芽必須進(jìn)行及時穩(wěn)定化處理。只有掌握了LA和LOX的酶學(xué)特性，在探明LA和LOX催化小麥胚芽脂質(zhì)酸敗變質(zhì)的機(jī)制基礎(chǔ)上，才能開發(fā)可靠的小麥胚芽穩(wěn)定化技術(shù)與裝備，為小麥胚芽的進(jìn)一步利用創(chuàng)造條件。

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Mechanism of Acidification and Deterioration of Wheat Germ during Storage

Xu Bin1Li Bo1Miao Wenjuan1Xu Shanyuan2Dong Ying1

(School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University1，Zhenjiang 212013)
(Fada Flour Co．，Ltd．2，Xiajin 253216)

Wheat germ(WG)contains abundant nutriments，such as high quality proteins，polyunsaturated fatty acid and vitamin E，as well as lipoxygenase(LOX)，lipases(LA)and ester enzyme．Fresh WG deteriorates within two weeks at room temperature and catalyzed by enzymes and microbes，which greatly limited its utilizing efficiency．This paper expatiated the types of LOX and LA from WG，as well as their structure and catalyzing mechanism．Also，the author analyzed the mechanism of acidification and deterioration of WG during storage from perspectives of catalyze hydroxylation and oxidation of LOX，LA，and contamination of microbes．Deep understanding of wheat germ LOX and LA contributed greatly to technology and equipment devising of WG stabilization．

wheat germ，lipoxygenase，lipases，microbe，mechanism，rancidity

TS210．7

A

1003－0174(2011)09－0123－06

江蘇省研究生培養(yǎng)創(chuàng)新工程(CX09B－213Z)

2010－11－29

徐斌，男，1969年出生，副教授，糧油加工副產(chǎn)物的深加工技術(shù)研究與裝備開發(fā)