枯草芽孢桿菌產(chǎn)彈性蛋白酶對(duì)肉嫩化的工藝研究

韓建春，邢明偉

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

枯草芽孢桿菌產(chǎn)彈性蛋白酶對(duì)肉嫩化的工藝研究

韓建春1，邢明偉2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

從前期研究枯草芽孢桿菌胞外分泌物中獲得彈性蛋白酶，將之應(yīng)用到豬肉背最長(zhǎng)肌和牛主動(dòng)脈，通過彈性蛋白酶溶液浸泡，采用嫩度計(jì)和電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)此彈性蛋白酶作用于豬肉和主動(dòng)脈，50℃，50min，添加量為4%，可以提高豬肉的嫩度。彈性蛋白酶的添加使牛主動(dòng)脈的組織紋理打破，出現(xiàn)斷裂和孔隙，可以使牛主動(dòng)脈的韌度下降。

彈性蛋白酶，嫩度，剪切力

肉的嫩度是消費(fèi)者重視的食用品質(zhì)之一［1］。為了獲得較好的嫩度，肉類工業(yè)中常采取一些嫩化技術(shù)。目前，國(guó)內(nèi)外主要利用木瓜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和菠蘿蛋白酶的降解作用，進(jìn)行畜肉類的嫩化［2］。其中，木瓜蛋白酶的效果最好，但是它不能水解未處理過的彈性蛋白［3］。彈性蛋白酶主要作用于中性非芳香族氨基酸殘基的羧基端肽鍵。因此，彈性蛋白酶對(duì)彈性蛋白表現(xiàn)出很高的水解特性［4］。另外，由于彈性蛋白酶可優(yōu)先水解肉類中堅(jiān)韌的彈性纖維部分，真正起到使肉類嫩化又不會(huì)改變口味和風(fēng)味的作用，而不是單純地對(duì)食用蛋白加以非選擇性部分消化。由于彈性蛋白酶能夠高度專一水解結(jié)締組織中的膠原和硬蛋白，不破壞其它成分，從而達(dá)到肉類嫩化而不失其口味的目的，彈性蛋白酶的嫩化作用明顯優(yōu)于目前普遍使用的肉類嫩化劑［5］。因此可以作為理想的肉類嫩化劑用于食品加工業(yè)。另外，彈性蛋白酶除了在食品工業(yè)中有重要的應(yīng)用外，它還廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥業(yè)、日用化學(xué)以及制革業(yè)等，有著極高的應(yīng)用價(jià)值［6］。彈性蛋白酶既可以由動(dòng)物胰臟提取，也可以由微生物發(fā)酵制得。目前，國(guó)內(nèi)外仍主要利用動(dòng)物胰臟生產(chǎn)彈性蛋白酶，原料來源和中間環(huán)節(jié)限制了彈性蛋白酶的產(chǎn)量，并導(dǎo)致其價(jià)格昂貴。利用微生物生產(chǎn)彈性蛋白酶不僅能夠大量生產(chǎn)，降低彈性蛋白酶的生產(chǎn)成本，而且能為彈性蛋白酶的廣泛應(yīng)用提供方便。但是現(xiàn)在分離得到的產(chǎn)酶菌株都不同程度的存在著一定的毒性，對(duì)人體存在著潛在的危害，而且篩選到的菌株產(chǎn)酶水平較低，酶活性低，穩(wěn)定性較差［7-10］。本研究以一株無致病性的枯草芽孢桿菌為產(chǎn)酶菌株，獲得彈性蛋白酶，通過電鏡觀察酶添加對(duì)彈性蛋白的影響，以此為彈性蛋白酶的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)行探索研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌 購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，菌種編號(hào)10071；豬肉 哈爾濱市香坊區(qū)中央紅超市；牛主動(dòng)脈 哈爾濱市南崗區(qū)早市；彈性蛋白酶 為本研究提純獲得；干酪素、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；β-環(huán)糊精 上海山浦化工有限公司；硼砂-硼酸緩沖液，Tris-HCl緩沖液；試劑 均為分析純。

pHS-3C型pH計(jì) 上海精密儀器科學(xué)有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；牛津杯、電子天平、分析天平、離心機(jī)、水浴鍋、嫩度計(jì)、掃描電鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 彈性蛋白酶水解能力的測(cè)定方法 取豬背最長(zhǎng)肌切10cm×3cm×1cm條塊，牛主動(dòng)脈4cm長(zhǎng)，放在含有彈性蛋白酶的溶液中浸泡，對(duì)照組采用同樣的方式。

1.2.2 肉嫩度的測(cè)定方法 取肉樣，在室溫條件下置于剪切儀上測(cè)定剪切肉樣所需的剪切力值，以N為單位表示，數(shù)值越小，肉越嫩。測(cè)三次計(jì)算平均值。

1.2.3 掃描電鏡觀察的方法 取用彈性蛋白酶粗提液浸泡處理過的主動(dòng)脈，順著紋理切成2mm×3mm的長(zhǎng)方形小塊，在固定液中固定1.5h左右后取出。將固定好的主動(dòng)脈用pH為6.8的緩沖溶液沖洗三次，每次10min。將用緩沖液處理后的主動(dòng)脈分別用50%、70%、90%的乙醇脫水，每次10～15min；然后用100%的乙醇脫水三次，每次10～15min。乙醇脫水結(jié)束后將主動(dòng)脈先用乙醇∶叔丁醇=1∶1的溶液浸泡15min，再用叔丁醇浸泡15min。將用叔丁醇浸泡處理過的主動(dòng)脈凍干4h后噴金上膜，即可進(jìn)行電鏡觀察。

1.2.4 不同溫度下彈性蛋白酶對(duì)肉類的嫩化作用取彈性蛋白酶，在50、60、70℃條件下分別與豬肉、主動(dòng)脈作用，1h后測(cè)定肉的嫩度，同時(shí)用掃描電鏡觀察主動(dòng)脈的紋理，以不添加彈性蛋白酶的豬肉、主動(dòng)脈作為空白樣，測(cè)定不同溫度下，彈性蛋白酶對(duì)豬肉及主動(dòng)脈的嫩化情況。

1.2.5 不同時(shí)間彈性蛋白酶對(duì)肉類的嫩化作用 在50℃條件下，將彈性蛋白酶分別作用于豬肉、主動(dòng)脈，每隔10min測(cè)定一次肉的嫩度，同時(shí)觀察主動(dòng)脈的紋理變化，測(cè)定彈性蛋白酶對(duì)豬肉及主動(dòng)脈的嫩化情況。

1.2.6 不同添加量時(shí)彈性蛋白酶對(duì)肉類的嫩化作用將添加量為1%、2%、3%、4%、5%、6%的彈性蛋白酶分別作用于豬肉及主動(dòng)脈，待彈性蛋白酶與豬肉、主動(dòng)脈作用1h后，測(cè)定豬肉的嫩度，同時(shí)用掃描電鏡對(duì)主動(dòng)脈進(jìn)行觀察，測(cè)定不同添加量的彈性蛋白酶對(duì)豬肉及主動(dòng)脈的作用情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溫度下彈性蛋白酶對(duì)肉類的嫩化作用

由圖1看到，在50℃條件下，酶對(duì)肉的嫩化度為5.43%，60℃時(shí)嫩化度為5.36%，70℃時(shí)的嫩化度為3.64%，由此可見，在50℃條件下，彈性蛋白酶對(duì)豬肉的嫩化效果最好。彈性蛋白酶的活性較高。伴隨著溫度的升高，存在著酶活性降低、肌肉蛋白質(zhì)變性和收縮的問題，導(dǎo)致肉的剪切力增加、嫩度減小。

由圖2～圖4電鏡照片可以直觀地看出牛主動(dòng)脈紋理的變化情況。總的來說，未經(jīng)過酶處理的主動(dòng)脈紋理都比較清晰，經(jīng)過酶處理以后，紋理變的雜亂，并出現(xiàn)斷裂。尤以50℃處理后，牛主動(dòng)脈的斷裂更加明顯，進(jìn)一步說明50℃是彈性蛋白酶的最適溫度。伴隨著溫度的提升，對(duì)于主動(dòng)脈的水解有一定的促進(jìn)作用，而酶添加后，水解的發(fā)生比未添加酶明顯。

圖1 不同溫度彈性蛋白酶處理60min對(duì)肉類的嫩化作用

圖2 50℃條件下A（不加酶）與B（加酶）牛主動(dòng)脈的1700倍電鏡照片

圖3 60℃條件下A（不加酶）與B（加酶）牛主動(dòng)脈的1700倍電鏡照片

圖4 70℃條件下A（不加酶）與B（加酶）主動(dòng)脈的1700倍電鏡照片

2.2 不同酶解時(shí)間對(duì)肉類的嫩化作用

由圖5可以看出，隨著時(shí)間的變化，酶對(duì)豬肉的嫩化效果更加明顯，在50min后，嫩化的速度降低。圖6電鏡照片顯示的是在不同時(shí)間，主動(dòng)脈紋理的宏觀變化情況。由照片可以看出，主動(dòng)脈的紋理越來越不清晰，變得雜亂，說明酶破壞了主動(dòng)脈的肌束，使得主動(dòng)脈得到嫩化。開始時(shí)主動(dòng)脈的條理分明，但是隨著與酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，條紋先是出現(xiàn)不再整齊的排列現(xiàn)象，而后空隙變大；接著出現(xiàn)斷裂及紋理的位移，如圖6-D、6-E、6-F，這種紋理的變化隨著主動(dòng)脈與酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)而越發(fā)明顯，說明彈性蛋白酶對(duì)彈性蛋白的作用隨著時(shí)間的變化而加強(qiáng)。但是超過50min，嫩化的速度降低，可能與酶的活性降低有關(guān)。

圖5 不同時(shí)間彈性蛋白酶對(duì)肉類的嫩化作用

圖6 50℃條件下加酶處理的牛主動(dòng)脈不同時(shí)間后500倍電鏡照片

2.3 不同添加量對(duì)于肉類的嫩化作用

如圖7可見，固定作用溫度50℃，時(shí)間50min，我們發(fā)現(xiàn)不同的酶添加量對(duì)于豬肉的嫩化效果也不相同。添加酶組分隨著酶添加量的增加，肌肉的剪切力逐漸降低，綜合考慮生產(chǎn)成本、加工程序等因素，初步認(rèn)為4%的添加量可以實(shí)現(xiàn)肉嫩度的提高。由圖8我們看到，隨著彈性蛋白酶添加劑量的增加，牛主動(dòng)脈的紋理變得雜亂，出現(xiàn)裂隙和孔洞，說明了彈性蛋白酶作用導(dǎo)致主動(dòng)脈壁的彈性蛋白分解，組織解體，堅(jiān)韌度下降，嫩度提高。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)研究得到的彈性蛋白酶應(yīng)用于對(duì)豬肉及主動(dòng)脈的嫩化，在50℃條件下，4%左右添加量的彈性蛋白酶與豬肉及主動(dòng)脈作用50min，嫩化的效果較好。

圖7 不同添加量的酶對(duì)肉的嫩化情況

圖8 50℃條件下加酶處理的牛主動(dòng)脈不同蛋白酶添加量的1700倍電鏡照片

［1］孔保華，馬麗珍.肉品科學(xué)與技術(shù)［M］.第一版.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版，2003：216.

［2］何國(guó)慶，丁立孝.食品酶學(xué)［M］.第一版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：125.

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［5］張娟，劉書亮.彈性蛋白酶在肉類工業(yè)中的應(yīng)用［J］.肉類研究，2007，98（4）：19-21.

［6］王娟麗，王以強(qiáng)，李奠礎(chǔ)，等.微生物生產(chǎn)彈性蛋白酶現(xiàn)狀研究［J］.山西化工，2005，25（4）：34-36.

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［9］孫秀華，張昌蓮.從一例外傷病人的創(chuàng)面分離一株芳香黃桿菌.中國(guó)社區(qū)醫(yī)師（綜合版），2006（12）：68-72.

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Study on application of extracellular elastase by Bacillus.Subtilis in meat

HAN Jian-chun1，XING Ming-wei2
（1.College of Food Science，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China；2.College of Wildlife Source，Northeast Forest University，Harbin 150040，China）

The elastase can tender the porcine longissimus dorsi muscle and the borvine aorta by adding the extracellular elastase from Bacillus.Stubtilis.By the muscle tenderness meter and electron microscopic observation，the condition of 50℃，4%addition elastase and reaction 50min had best tenderization result to pork.The ligament of borvine aorta was broken by the addition of elastase.

elastase；tender；shearing force

TS201.3

A

1002-0306（2011）02-0166-04

2010-02-26

韓建春（1973-），男，博士，副教授，研究方向：畜產(chǎn)品加工。

黑龍江省科技廳攻關(guān)項(xiàng)目（GA07B401-3）。