劉 燁，吳 舟，王國良，李共國

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201300；2.浙江萬里學(xué)院寧波市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點實驗室，浙江寧波315100）

4種真菌制備海藻曲及其產(chǎn)香特征的初步研究

劉 燁1，吳 舟2，王國良2，李共國2

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201300；2.浙江萬里學(xué)院寧波市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點實驗室，浙江寧波315100）

以曲中蛋白酶和糖化酶活力為主要指標(biāo)，研究了4種真菌單獨制備海藻曲及其產(chǎn)香特征。結(jié)果表明：米曲霉在麩皮制曲中的繁殖能力最強，黑曲霉與魯氏毛霉次之，魯氏酵母生長速度最慢。以黑曲霉為菌種，物料比為海帶∶大豆∶面粉=6∶3∶1制備的海帶曲中蛋白酶活力高達(dá)4.15g氨基態(tài)氮/100g（干基），糖化酶活力為948.8U/g。應(yīng)用GC-MS方法測得黑曲霉海帶曲發(fā)酵3d和8d時的風(fēng)味物質(zhì)六大類共31種物質(zhì)，其中構(gòu)成良好風(fēng)味的主要成分為丁酸丁酯、正丁醇、丁酸和乙酸乙酯，它們的總相對含量分別為89.66%（3d）和83.06%（8d）。

海藻，單菌種，制曲，風(fēng)味

海藻所含的微量元素和各種維生素量遠(yuǎn)超過陸地植物［1］，因此，近年來海藻廣泛應(yīng)用于功能性食品、特效食品添加劑及保健品領(lǐng)域，而將微生物發(fā)酵用于海藻的加工研究卻鮮有報道。由于有些真菌可產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和糖化酶等多種酶，利用它們的協(xié)同作用發(fā)酵，得到的產(chǎn)品具有營養(yǎng)豐富、易于消化吸收等優(yōu)點［2］。如果這些微生物用于海藻醬發(fā)酵，可以很好地覆蓋海藻腥味，提高其使用價值和經(jīng)濟效益。因此，本文將米曲霉、黑曲酶、魯氏毛霉和魯氏酵母分別接種到添加了不同輔料的海藻中，以探索最優(yōu)的發(fā)酵菌種和添加輔料，并用GC-MS方法測定分析醬醅的風(fēng)味物質(zhì)，為海藻醬的加工開發(fā)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

干制海帶、紫菜、面粉、大豆、蠶豆 均為市售；米曲霉 GW3042、黑曲霉 As 3.1860、魯氏毛霉 As 3.3447、魯氏酵母As 2.180 購自廣州市微生物研究所；甲醛、無水乙醇、碘化鉀、無水乙酸鈉、硫代硫酸鈉、氫氧化鈉、可溶性淀粉、碘、酚酞、麝香草酚藍(lán)均為分析純。

HR73P型水分測定儀，電子天平，高速萬能粉碎機，鼓風(fēng)干燥箱，滅菌鍋，生物顯微鏡，智能生化培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 海藻醬加工流程

表1 不同種曲的生長狀況比較

表2 添加不同輔料后海帶和紫菜曲種的孢子量（109個/g）

表3 海帶（紫菜）曲中蛋白酶和糖化酶活力、曲水分及其香味特征

1.2.2 不同種曲的生長比較 麩皮與水混合后制成半固體培養(yǎng)基放入滅菌鍋內(nèi)［3］，0.1MPa滅菌30min，取出后趁熱搖散錐形瓶中的麩皮塊，分別接入各種含菌蒸餾水10mL（含孢子量108個/mL）。在30℃下培養(yǎng)，當(dāng)菌絲蔓延將麩皮連成餅狀時，即行扣瓶（將瓶輕輕放倒，使麩皮餅脫離瓶底）［4］，3d后測定孢子量。測定方法為稱取培養(yǎng)成的各種曲1g，溶于20mL蒸餾水中（含2‰吐溫），在顯微鏡下進行計數(shù)，并對它們的生長情況進行感官描述。

1.2.3 制曲 海藻、豆和面粉按上述工藝流程殺菌冷卻后混合，接入5%的種曲，發(fā)酵3d后制成成曲。

1.2.4 海藻曲中添加不同輔料實驗 在海帶和紫菜中分別添加一定比例的面粉、蠶豆+面粉和大豆+面粉。添加比例分別為海帶（紫菜）∶面粉=9∶1；海帶（紫菜）∶蠶豆∶面粉=6∶3∶1；海帶（紫菜）∶大豆∶面粉= 6∶3∶1，以此來比較各種曲的生長情況。

1.2.5 海藻曲指標(biāo)測定 海藻曲中蛋白酶和糖化酶活力測定分別采用SB/T 10317-1999（甲醛法）和GB 8276-87法，曲水分測定用HR73P型水分測定儀。

1.2.6 風(fēng)味特征分析 用頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定樣品的風(fēng)味物質(zhì)；通過GC-MS分析測出總離子流圖，分析樣品中主要的風(fēng)味物質(zhì)成分及其相對含量［5］。色譜條件：HP-INNOWAX柱（30m× 250μmi.d×0.25μm，df）；進樣口溫度，250℃；程序升溫，50℃（2min）→240℃（15min）；氦氣流速為1mL/min。質(zhì)譜條件：EI源電子能量70eV，電子倍增器電壓1650eV；質(zhì)量掃描范圍為30～550AMU，離子源溫度230℃，四極桿溫度130℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種曲的生長狀況

米曲霉在麩皮中的繁殖能力最強，黑曲霉與魯氏毛霉次之，魯氏酵母生長速度最慢。魯氏酵母孢子量比前3種菌種少4～5個數(shù)量級（見表1）。

2.2 添加不同輔料后海藻曲的發(fā)酵特征

在海帶和紫菜中添加一定比例的大豆或者蠶豆時，除魯氏酵母曲種的孢子量明顯較低以外，其余各曲種的生長狀態(tài)較好；在不同輔料配比中，僅添加面粉的曲種其孢子量明顯下降，黑曲在海帶中添加大豆明顯比添加蠶豆好，米曲則剛好相反（表2）。

2.3 海藻曲的蛋白酶和糖化酶活力及產(chǎn)香特征

4種真菌分別對添加輔料的海帶和紫菜進行單菌種制曲，各海藻曲的蛋白酶和糖化酶活力及產(chǎn)香特征見表3。曲中的蛋白酶活力，除黑曲霉制成的海帶曲和米曲霉制成的紫菜曲以添加大豆為最高，分別達(dá)4.15、2.98g氨基態(tài)氮/100g（干基）外，其余各藻曲均以添加蠶豆為最高；曲中的糖化酶活力，除魯氏毛霉制成的紫菜曲以添加大豆為最高外，其余各藻曲也均以添加蠶豆為最高，其中尤以黑曲霉制成的海帶曲糖化酶活力為最高，達(dá)2308.0U/g；不添加蠶豆或大豆時，曲中的水分較高；曲中的香味以接種黑曲霉和魯氏毛霉曲種為較好，接種魯氏酵母曲種產(chǎn)生了微臭氣味，可能與魯氏酵母生長速度慢，孢子量少，易被細(xì)菌污染有關(guān)。

表4 樣品發(fā)酵3d和8d風(fēng)味成分種類與其相對含量變化

制曲的目的是使真菌分泌大量的蛋白酶、糖化酶和脂肪酶等酶類，以備后期發(fā)酵所用，其中尤以蛋白酶為最重要，直接影響原料的蛋白利用率和最終產(chǎn)品的風(fēng)味［6］?？梢姡煤谇怪苽涞暮哂凶罡叩牡鞍酌富盍洼^高的糖化酶活力，香味也較好，其最好的添加輔料是大豆和面粉。

2.4 產(chǎn)香特征分析

由2.3實驗結(jié)果，取黑曲霉在海帶+大豆+面粉的混合料中發(fā)酵制得的曲為樣品。用GC-MS方法分別測得醬醅發(fā)酵時間為3d和8d時揮發(fā)性物質(zhì)總離子流色譜圖，通過譜圖檢索并結(jié)合有關(guān)文獻，鑒定出31種物質(zhì)，分別為醇（2種）、醛酮（4種）、酸（3種）、烴（4種）、酯（14種）和雜環(huán)化合物（4種）六大類。10種成分在兩次測定時同時檢出，11種成分為發(fā)酵3d特有，10種成分為發(fā)酵8d特有。風(fēng)味物質(zhì)的主要成分與其相對含量變化見表4。

正丁醇、丁酸丁酯、丙酮、丁酸、乙酸丁酯等為3d和8d兩次測量都存在的主要成分，這些成分總和分別超過96.55%和88.59%；酯類和醇類可以產(chǎn)生使人愉快的氣味，酸類可以緩和咸味，使口感柔和［7］。正丁醇的相對含量隨著發(fā)酵時間的推延下降明顯，可能是由于醇類可與多種酸作用生成酯類，這也說明了隨著發(fā)酵時間的延長，酯類物質(zhì)含量有所增加的原因。楊海帆等證明野西瓜果實正丁醇提取物有抗腫瘤作用［8］，丁酸丁酯具有蘋果、香蕉、菠蘿等果香香味，主要用于配制果實香精，是我國GB 2760-86規(guī)定允許使用的食用香精［9］，而影響風(fēng)味形成的主要物質(zhì)可能是丙酮，其對海藻醬風(fēng)味的影響還有待進一步的研究。

3 結(jié)論

3.1 4種真菌種中，以米曲霉在麩皮中的繁殖能力最強，黑曲霉與毛霉次之，酵母生長速度最慢，使酵母種曲中的孢子量僅為2.1×106個/g，導(dǎo)致其在制曲過程中被細(xì)菌污染，產(chǎn)生臭味。

3.2 用黑曲霉制備種曲，添加大豆+面粉輔料制成的海帶曲，其蛋白酶活力最高，達(dá)4.15g氨基態(tài)氮/ 100g（干基），糖化酶活力為948.8U/g，是海帶加工海藻醬較好的菌種。

3.3 應(yīng)用GC-MS方法鑒定出醇、醛酮、酸、烴、酯、雜環(huán)化合物六大類，31種物質(zhì)。在發(fā)酵3d和8d兩次測定中，風(fēng)味物質(zhì)成分及其相對含量變化較大，但相對含量較高的主要風(fēng)味物質(zhì)正丁醇、丁酸丁酯、丁酸和乙酸乙酯等較穩(wěn)定，相對含量的變化主要表現(xiàn)為醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)轷ヮ愇镔|(zhì)。

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Prelimiary study on fermentation and flavour specificity of producing seaweed leaven using four fungi

LIU Ye1，WU Zhou2，WANG Guo-liang2，LI Gong-guo2
（1.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201300，China；2.Key Lab of Agricultural Processing Technology of Ningbo，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

The fermentation and flavour specificity of producing seaweed leaven using four fungi were studied by following parameters：proteinase and glucoamylase activity.Results showed that Aspergillus oryzae（GW3042）grew up the fastest in all of the four fungi，Aspergillus nige（rAs 3.1860）and Mucor rouxi（iAs 3.3447）took the second place，developed much faster than that of Saccharomyces roux（iiAs 2.180）in preparing bran mother culture.Kelp leaven，which produced with Aspergillus niger，materal proportion of kelp∶soybean∶flour=6∶3∶1，was of high proteinase activity for 4.15g AAN/100g（dry substrate），948.8U/g of glucoamylase activity.According to GC-MS analysis，a total of 31 species volatiles were indentified in the leaven which were fermented after 3d and 8d，among these the main flavour substances were butyl butyrate，n-butanol，butyric acid and ethyl acetate，their total relative content were 89.66%and 83.06%，respectively.

seaweed；single fungus；producing leaven；flavour

TS254.1

A

1002-0306（2011）02-0139-04

2009-10-23

劉燁（1985-），女，碩士在讀，研究方向：水產(chǎn)品加工。