張英，袁月，孫富麗

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院綜合急診科，沈陽(yáng) 1 1 0 0 0 2）

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）廣泛存在于機(jī)體各組織器官中，主要是肝、腎、胎盤(pán)、小腸和骨。人體血清中ALP主要由肝臟及成骨細(xì)胞合成（幾乎各占50%），分別稱(chēng)為肝源性及骨源性堿性磷酸酶。ALP是成骨細(xì)胞所分泌的一種酶蛋白，是成骨細(xì)胞分化的特異性標(biāo)志，是最常見(jiàn)評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞分泌功能的指標(biāo)之一。所以，ALP的檢測(cè)結(jié)果對(duì)成骨細(xì)胞的研究有重要意義。目前檢測(cè)ALP的實(shí)驗(yàn)方法很多，文獻(xiàn)中常用的方法可概括分為2類(lèi)：直接取成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)、將成骨細(xì)胞破碎后進(jìn)行檢測(cè)。成骨細(xì)胞分泌的ALP是細(xì)胞內(nèi)多還是在細(xì)胞外多，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法的選擇及實(shí)驗(yàn)結(jié)果都會(huì)造成一定影響。本實(shí)驗(yàn)就此問(wèn)題進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器、試劑

出生24 h的大鼠，雌雄不限，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。主要儀器：超凈工作臺(tái)，培養(yǎng)箱，相差顯微鏡，低溫離心機(jī)。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司，美國(guó)），胎牛血清（sigma公司），HEPES（AM-RESCO 公司，美國(guó)），青／鏈霉素、Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國(guó)），胰蛋白酶（GIBCO公司，美國(guó)），ALP染色試劑盒（碧云天公司），Ⅰ型膠原免疫熒光染色試劑盒（abcam公司，美國(guó)），ALP含量測(cè)定試劑盒（昊柏公司）。

1.2 成骨細(xì)胞的分離、接種與傳代

采用酶交替消化法對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行分離［1］。將4只大鼠胎鼠浸泡于75%乙醇中5 min，取出后放入培養(yǎng)皿中，剝出顱骨，放入有雙抗的PBS液中浸泡。移入超凈臺(tái)內(nèi)，用PBS將取下的顱骨沖洗3次。加入0.25%的胰酶，重復(fù)3次加入2 mL（1 mg/mL）的Ⅰ型膠原酶交替消化；收集消化液，加入4 mL高糖培養(yǎng)基終止消化。低溫離心機(jī)1 000 r/min離心10 min，棄去上清；將沉淀移入培養(yǎng)瓶中，加入5 mL10%高糖培養(yǎng)基；放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)。以后每3 d換1次培養(yǎng)液，每5~7 d傳代1次。

1.3 成骨細(xì)胞鑒定

1.3.1 相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

1.3.2 ALP染色：將培養(yǎng)第4代的成骨細(xì)胞在蓋玻片上爬片，多聚甲醛固定30 min。0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。用碧云天ALP染色試劑盒染色，避光孵育24 h。

1.3.3 Ⅰ型膠原免疫熒光染色：用4%多聚甲醛固定30 min，應(yīng)用abcam試劑盒染色，避光在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 茜素紅染色：培養(yǎng)皿用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10 min，雙蒸水沖洗3次。0.1%茜素紅-Tris-Hcl（pH 8.3）37℃，30 min。

1.3.5 ALP 含量測(cè)定：（1） 將傳代后 1 d、2 d、3 d 的細(xì)胞分別設(shè)定為第1，2，3組，每組各取5瓶，將每瓶的培養(yǎng)液取出設(shè)為對(duì)照組；將相同培養(yǎng)瓶瓶底的細(xì)胞消化下來(lái)，使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將細(xì)胞粉碎，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。（2）將1 mL反應(yīng)液R1加到比色杯中，37℃孵育3 min后加入20 μL待測(cè)樣品，攪勻并保溫30 s。（3）加入 250 μL 反應(yīng)液 R2到比色杯中，攪勻并保溫30 s。（4）然后用酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)測(cè)定405 nm處2 min到10 min內(nèi)的吸光度變化計(jì)算這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值的差值，計(jì)算差值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 相差顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞形態(tài)

接種前成骨細(xì)胞呈體積均一的圓形細(xì)胞，接種24 h后，少量細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，顯微鏡觀察貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞為長(zhǎng)梭形或有2~3個(gè)突起，胞質(zhì)透亮、飽滿。部分細(xì)胞突起為3~4個(gè)，體積較前明顯增大，似星形，顯示出較好的貼壁性，部分區(qū)域出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)以及輻射生長(zhǎng)的現(xiàn)象。第2代細(xì)胞貼壁后增殖加快，形態(tài)以不規(guī)則形、長(zhǎng)梭形、三角形為主，相鄰細(xì)胞彼此貼靠，細(xì)胞內(nèi)及表面開(kāi)始出現(xiàn)分泌物。見(jiàn)圖1。

2.2 ALP染色結(jié)果

細(xì)胞均染色呈梭形、多角形，細(xì)胞質(zhì)染色呈深藍(lán)色。見(jiàn)圖2。2.3 Ⅰ型膠原免疫熒光染色

細(xì)胞均染色呈梭形、多角形，細(xì)胞質(zhì)染色發(fā)出紅光。見(jiàn)圖3。

2.3 茜素紅染色

在顯微鏡下觀察，細(xì)胞間分泌的鈣結(jié)節(jié)被染成紅色。見(jiàn)圖4。

2.4 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組ALP含量比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：成骨細(xì)胞內(nèi)分泌的ALP比成骨細(xì)胞外分泌的ALP高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

分別對(duì)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的3組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P值結(jié)果如下表：從表1可以看出：當(dāng)?shù)?天與第5天、第3天與第5天進(jìn)行ALP含量比較時(shí)，如果將細(xì)胞破碎檢測(cè)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，直接取培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故直接取培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)的方法可能降低了差異大小，最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表1 3組數(shù)據(jù)組間差異的分析結(jié)果（P）T a b.1 T h e a n a l y s i s r e s u l t s o f 3 d a t a g r o u p s（P）

3 討論

ALP是Suzuki等在1907年首先發(fā)現(xiàn)的，生理作用是非特異性水解磷酸單酯鍵，最適pH值為8.6~10.3，因此稱(chēng)為ALP，臨床上長(zhǎng)期用作診斷肝、膽和骨組織疾病的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)之一［2，3］。ALP主要產(chǎn)生于肝臟、骨和胎盤(pán)，也可產(chǎn)生于腎和小腸。有4種同工酶，分別為肝、骨、小腸和胎盤(pán)型。ALP廣泛存在機(jī)于體各組織器官中，主要是肝、腎、胎盤(pán)、小腸和骨。ALP活性是很多細(xì)胞如成骨細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞、牙髓細(xì)胞等的功能及分化程度的指標(biāo)。在細(xì)胞中表達(dá)的多少，反映出細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)，因此定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ALP活性具有非常重要的意義。ALP是成骨細(xì)胞所分泌的一種酶蛋白，活性的高表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的特異性標(biāo)志［4，5］，是最常見(jiàn)評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞分泌功能的指標(biāo)之一。ALP含量可以間接反應(yīng)成骨細(xì)胞的功能，測(cè)定血清ALP含量可反映骨代謝活動(dòng)。

目前，血清中ALP活性的檢測(cè)方法已成熟并廣泛應(yīng)用于臨床。而對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)ALP活性的檢測(cè)卻缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法，并且研究較少。目前文獻(xiàn)中關(guān)于體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)ALP的檢測(cè)方法有很多種，可概括分為2類(lèi)：直接取成骨細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)，將成骨細(xì)胞破碎進(jìn)行檢測(cè)。由于各實(shí)驗(yàn)室條件不同，可以將后者分為反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞［6］、使用Triton-X100［7］破碎細(xì)胞、使用超聲破碎儀破碎細(xì)胞。直接檢測(cè)培養(yǎng)基中的ALP這種方法［8］，操作簡(jiǎn)便，但成骨細(xì)胞內(nèi)分泌的ALP比細(xì)胞外分泌的高，故該實(shí)驗(yàn)方法降低了各比較組之間的差異，外低于內(nèi)從而從側(cè)面影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，如表2。Triton-X100是一種非離子型表面活性劑，對(duì)細(xì)胞起到打孔的作用，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便［9］，但有化學(xué)試劑的參與將會(huì)對(duì)酶的活性或試劑的反應(yīng)造成影響，而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。反復(fù)凍融的方法檢測(cè)ALP，屬于物理的方法，沒(méi)有化學(xué)試劑的參與，避免了對(duì)檢測(cè)試劑盒的影響，并且該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但在反復(fù)凍融過(guò)程中容易對(duì)ALP的活性造成影響，從而影響了最終結(jié)果；本實(shí)驗(yàn)采用超聲破碎儀破碎細(xì)胞，選用物理的方法破碎細(xì)胞，在破碎同時(shí)使用涼水物理降溫，盡量保存ALP的活性，使實(shí)驗(yàn)更加真實(shí)、可靠。

故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)、外分泌ALP的檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果證明：成骨細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)分泌的ALP與細(xì)胞外分泌的ALP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)胞內(nèi)分泌的ALP高。在分組時(shí)，考慮到細(xì)胞在體外生長(zhǎng)的周期，即可能的ALP分泌的變化。采用傳代后1 d、2 d、3 d，目的是使結(jié)果更加可信。并且，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組來(lái)自同一瓶細(xì)胞，排除了不同原代培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能造成的影響。

綜上所述，成骨細(xì)胞內(nèi)分泌的ALP比成骨細(xì)胞外分泌的ALP高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，建議盡量采用將細(xì)胞破碎的方法進(jìn)行ALP含量的檢測(cè)，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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