佟海俠，馬良艷，陸春偉，王秋實(shí)

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院輸血科，沈陽110022；2.中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)教研室，沈陽110001）

特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP）是一種常見的出血性自身免疫病，但發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，難以找到真正特異而有效的治療方法。近年來，越來越多的研究表明，ITP患者除有體液免疫異常外，都存在細(xì)胞免疫異常，發(fā)病與淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子表達(dá)及功能改變有密切聯(lián)系［1］。同時研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cell，Treg細(xì)胞）是維持機(jī)體免疫耐受的重要調(diào)控者，在自身免疫病中的作用逐漸成為研究的熱點(diǎn)。為了觀察淋巴細(xì)胞免疫功能在ITP發(fā)病機(jī)制中的可能作用及Treg細(xì)胞與ITP發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及其臨床意義，我們使用流式細(xì)胞分析儀檢測40例初診急性ITP患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的水平和Treg細(xì)胞的數(shù)量，并與40例健康者進(jìn)行比較，以觀察其在ITP發(fā)病中的變化和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象及分組：全部為中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院血液科門診及住院初診（治療前）急性ITP患者，診斷根據(jù)臨床血象和骨髓檢查確診，符合張之南《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［2］，ITP組40例，男18例，女22例，年齡3～43歲，中位年齡18歲；健康對照組40例，男24例，女16例，年齡19～54歲，中位年齡35歲。

1.1.2 主要試劑和儀器：MultiSET四色免洗淋巴細(xì)胞亞群試劑盒、FACS Lysing Solution紅細(xì)胞裂解液、人調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞檢測試劑盒（CD25-APC、CD4-FITC、Foxp3-PE）購自美國 BD 公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 淋巴細(xì)胞亞群檢測方法：采集外周靜脈血2.0 mL，EDTA-K2抗凝后備用。取2支FACS專用試管，各加入50 μL充分混勻的抗凝全血，分別加入20 μL CD3/CD8/CD45/CD4 抗體和20 μL CD3/CD16+56/CD45/CD19標(biāo)記的抗體。渦旋混勻，室溫避光放置15～20 min。取出加入 450 μL1×FACS 溶血素，充分混勻，避光放置15 min。24 h內(nèi)上機(jī)，用MultiSET軟件獲取15000個細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.2.2 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測方法：嚴(yán)格按照調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。流式細(xì)胞儀檢測分析應(yīng)用CellQuest軟件，在FSC-SSC散點(diǎn)圖上選定淋巴細(xì)胞群，再以CD4和SSC設(shè)門選擇CD4陽性細(xì)胞分析，分析CD25和Foxp3表達(dá)，檢測結(jié)果分別以CD4+CD25+、CD4+CD25high和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分率表示。以CD4+T細(xì)胞中表達(dá)CD25+熒光強(qiáng)度>CD4-T細(xì)胞中CD25+熒光強(qiáng)度者定義為CD4+CD25highT細(xì)胞。收集細(xì)胞數(shù)50000個/管。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果

ITP組CD3+T淋巴細(xì)胞百分比、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+的比值均顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CD8+T淋巴細(xì)胞百分比略升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），CD19+B淋巴細(xì)胞百分比則顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；CD16+/56+NK細(xì)胞百分比顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

2.2 ITP患者外周血CD4+CD25+、CD4+CD25high和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）表明ITP患者外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時檢測高表達(dá)CD25的CD4+T細(xì)胞（CD4+CD25high）和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量變化。結(jié)果顯示ITP患者中CD4+CD25highT細(xì)胞比例略高于正常對照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而ITP患者CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例低于對照組（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

T淋巴細(xì)胞在免疫反應(yīng)中起重要作用，是細(xì)胞免疫的重要環(huán)節(jié)，按免疫應(yīng)答中的功能不同，可將T細(xì)胞分成輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）和抑制性T 細(xì)胞（T suppressor cell，Ts）。CD4+T 細(xì)胞是 T 輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞的表面標(biāo)志，具有輔助T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成效應(yīng)細(xì)胞、B細(xì)胞轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞以及活化巨噬細(xì)胞等功能。CD8+是抑制性T細(xì)胞/細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cell，Tc）的表面標(biāo)志，能抑制 T 細(xì)胞活化、抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，起抑制細(xì)胞免抑和體液免抑的作用。細(xì)胞免疫與體液免疫相互促進(jìn)，同時相互制約，T細(xì)胞比例失調(diào)必然導(dǎo)致B細(xì)胞的改變。CD19是與B細(xì)胞分化、活化、增殖及抗體產(chǎn)生的重要膜抗原，是鑒定B細(xì)胞的標(biāo)志之一。CD16+56+是自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞的特異性標(biāo)志，NK 細(xì)胞對B細(xì)胞分化有抑制作用，能調(diào)節(jié)吞噬作用和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。

研究表明，Th/Ts細(xì)胞的平衡在自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［3］。Th細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的中心細(xì)胞，CD4+/CD8+細(xì)胞比值變化反應(yīng)機(jī)體的免疫功能狀況，比例升高表明免疫功能亢進(jìn)，比例降低表明免疫功能低下。淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果顯示ITP患者外周血NK細(xì)胞、CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和CD4+/CD8+比值均顯著低于對照組，CD8+T細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞高于對照組；以上結(jié)果與國內(nèi)其他文獻(xiàn)報道相同［4，5］。T細(xì)胞功能異常導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞激活，產(chǎn)生針對血小板的自身抗體可能是ITP的發(fā)病機(jī)制之一［6］。ITP患者CD19+B淋巴細(xì)胞的明顯升高提示B細(xì)胞活化可能是ITP抗血小板抗體產(chǎn)生的直接根源；另外ITP時NK細(xì)胞數(shù)量減少及活性降低，導(dǎo)致其對B細(xì)胞激活、增殖、分化和抗體應(yīng)答的抑制能力下降，從而使B細(xì)胞異?；罨?，產(chǎn)生大量自身抗體，進(jìn)而導(dǎo)致血小板的破壞增多。Johansson等［7］研究發(fā)現(xiàn)，激活的NK細(xì)胞能夠抑制ITP的自身免疫反應(yīng)。

1995年Sakaguchi等［8］首次發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞是一種專職抑制細(xì)胞，具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)作用，并在動物實(shí)驗(yàn)中將其去除后引發(fā)了多種自身免疫性疾病，而回輸后則可抑制上述疾病的發(fā)生。叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Fork-head/winged helix transcription factor，F(xiàn)oxp3）特異性地表達(dá)于Treg細(xì)胞，調(diào)節(jié)其發(fā)育、維持其功能，故被作為Treg細(xì)胞的特征性標(biāo)記［9］。人類體內(nèi)天然產(chǎn)生的Tregs來源于胸腺，占人外周血CD4+T細(xì)胞總數(shù)的5%～10%［10］。Treg細(xì)胞具有免疫無反應(yīng)性和免疫抑制性兩大功能特征。免疫無能性主要表現(xiàn)在對IL-2特異性抗原及抗原提呈細(xì)胞（APC）的刺激呈低反應(yīng)狀態(tài)，免疫抑制性則表現(xiàn)在TCR介導(dǎo)的信號刺激活化后能夠抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖。

我們觀察40例ITP患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比，結(jié)果顯示較正常對照組明顯增多；與羅祖軍、孫雨梅等［11，12］報道的 ITP患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞百分率低于對照組有明顯差異。考慮到ITP患者存在自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異?；罨鳦D25也是細(xì)胞活化標(biāo)志，活化的CD4+T效應(yīng)細(xì)胞表面也表達(dá)CD25分子，很難區(qū)分這兩群功能不相同的細(xì)胞，因此CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量并不能代表真正的調(diào)節(jié)T細(xì)胞水平；如果實(shí)驗(yàn)中直接按照外周血CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較，由于混雜有一些活化T細(xì)胞在內(nèi)，會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析有影響。Clare等［13］發(fā)現(xiàn)人類外周血中高表達(dá)CD25的CD4+T細(xì)胞（CD4+CD25highT細(xì)胞）具有動物實(shí)驗(yàn)中所觀察到的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所具有的低反應(yīng)性及免疫抑制性的特性，而低表達(dá)CD25的CD4+T細(xì)胞卻不具備上述特性，故認(rèn)為CD4+CD25highT細(xì)胞就是存在于人體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。然而本研究觀察到ITP患者外周血CD4+CD25highT細(xì)胞的比例并沒有減少，但CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例卻明顯低于對照組。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3可能是CD4+CD25+T細(xì)胞中主要的調(diào)節(jié)基因，是目前公認(rèn)的CD4+CD25+Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志，其他的淋巴細(xì)胞如CD4+CD25-T細(xì)胞、B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞僅表達(dá)少量的Foxp3。本研究在檢測Treg細(xì)胞時，以CD4+CD25+Foxp3+來識別Treg細(xì)胞，更準(zhǔn)確地反映了ITP患者Treg細(xì)胞數(shù)量的變化。

Treg細(xì)胞數(shù)量減少使機(jī)體內(nèi)免疫耐受平衡破壞，不能正常抑制T細(xì)胞的活化，使患者體內(nèi)存在大量活化的T淋巴細(xì)胞參與血小板的損傷。Liu等［14］發(fā)現(xiàn)活動期和非緩解期ITP患者Treg細(xì)胞百分比明顯低于病情緩解期和健康人群。Sakakura等［15］研究認(rèn)為抗血小板糖蛋白抗體陽性和病情嚴(yán)重的ITP患者Treg細(xì)胞數(shù)明顯降低，病情緩解后Treg細(xì)胞數(shù)上升，同時外周血單個核細(xì)胞的Foxp3-mRNA水平明顯增高。近來研究證實(shí)，Treg細(xì)胞通過抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，抑制T細(xì)胞的活化及促進(jìn)某些抑制性細(xì)胞因子的分泌等，在自身免免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［16］。以上結(jié)果均提示ITP患者外周血Treg細(xì)胞比例降低，由此導(dǎo)致細(xì)胞免疫抑制功能缺陷，自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化，輔助B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體。由于ITP患者發(fā)病時體內(nèi)Treg細(xì)胞水平降低，這提示我們可以以此為治療靶點(diǎn)，采取一些能夠提高Treg細(xì)胞水平及增強(qiáng)其功能的免疫療法，以扭轉(zhuǎn)患者體內(nèi)的免疫紊亂，促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)。

本研究初步證實(shí)ITP發(fā)病機(jī)制中存在淋巴細(xì)胞免疫異常和免疫功能紊亂，淋巴細(xì)胞亞群水平和Treg細(xì)胞檢測的聯(lián)合使用對ITP的診斷及療效觀察有較好的實(shí)用價值。通過促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增生分化，增強(qiáng)其免疫抑制功能，為有效運(yùn)用免疫調(diào)節(jié)手段治療難治性ITP開辟了一條新途徑。

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