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五蓮黑豬IFN-γ基因克隆、序列分析及同源建模研究

王海洲 （山東省日照市畜牧站 276800） 丁永貴 （山東省平邑縣畜牧獸醫(yī)局）賈曉暉 （山東省日照市畜牧獸醫(yī)局）

從GenBank/DDBJ/EMBL基因庫(kù)中讀取豬IFN-γ基因進(jìn)行序列分析設(shè)計(jì)引物，基因組中克隆了IFN-γ基因序列并分析其基因組結(jié)構(gòu)，運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，同源建模分析，發(fā)現(xiàn)該基因由氨基末端結(jié)構(gòu)域和羧基末端結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。

五蓮黑豬 IFN-γ 基因組 同源建模

五蓮黑豬屬華北型豬，是山東省地方良種，該品種毛色純黑、適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、肉質(zhì)優(yōu)良、肉味鮮美、抗病力強(qiáng)生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)仔數(shù)高等特點(diǎn)，深受日照市五蓮縣及魯南地區(qū)群眾的喜愛(ài)，一度成為當(dāng)?shù)氐漠?dāng)家品種，經(jīng)濟(jì)雜交優(yōu)勢(shì)明顯，是生產(chǎn)瘦肉豬的良好母本。隨著豬肉生產(chǎn)日益向著瘦肉方向的發(fā)展，瘦肉率與肉質(zhì)間的負(fù)相關(guān)所造成的不利影響也明顯地表現(xiàn)出來(lái)。據(jù)報(bào)導(dǎo)瘦肉率較高的品種或品系，應(yīng)激敏感豬(PSS豬)較多，PSE(pale, soft&exudative)肉和DFD(dark, firm&dry)肉的發(fā)生率也較高，因而導(dǎo)致了豬肉品質(zhì)的下降，嚴(yán)重地影響了肉的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，鑒于國(guó)外這種情況，研究和發(fā)掘我國(guó)地方品種，對(duì)于改良生豬性能具有重要的意義。

豬干擾素-γ(interferon-gamma, IFN-γ)是一種具有強(qiáng)烈抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，主要由激活的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[1,2]。研究證實(shí)，IFN-γ作為生物藥劑或疫苗佐劑具有安全、高效、無(wú)毒副作用等特點(diǎn)[3,4]。1990年Dijikmans等[5]首先克隆了含內(nèi)含子的豬IFN-γ基因。隨后，Vandenbroeck等[6]又分段克隆了豬IFN-γ基因的外顯子并將其拼接為完整基因后進(jìn)行了原核表達(dá)。此后不斷有關(guān)于豬IFN-γ基因克隆和表達(dá)的報(bào)道[7,8]。為了研究和開(kāi)發(fā)新型的疫苗佐劑和相關(guān)生物制劑，有效控制一些嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，本研究通過(guò)對(duì)豬外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)刺激誘導(dǎo)后，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈(RT-PCR)技術(shù)克隆了豬IFN-γ基因，并對(duì)其序列進(jìn)行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 試劑盒及試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化態(tài)受體菌株為DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體為pMD-18T，購(gòu)自Takara公司；

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 50周齡五蓮黑豬10頭由日照港物業(yè)有限公司五蓮黑豬保種基地提供；

1.1.3 引物設(shè)計(jì) 登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)登錄的豬(NM_214078.1)的IFN-γ基因序列，在其閱讀框外側(cè)用Oligo軟件設(shè)計(jì)引物：上游引物5′-TCTCTCCGAAACAAT GAGTTA-3′，下游引物5′-TAATAGATACCCATTTTCATC ACA-3′，上述引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.1.4 工具酶及試劑 RNA提取試劑盒、dNTP、LA-Taq酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA MakerDL2000、質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自Takara生物公司；瓊脂糖、RNasin、氨芐青霉素、X-gal、IPTG購(gòu)自華美生物工程公司；T4連接酶購(gòu)自TOY-OBO生物公司；胰蛋白胨、酵母提取物為OXID產(chǎn)品。

1.2 五蓮黑豬IFN-γ基因克隆與鑒定

1.2.1 總RNA的提取 取凍存的五蓮黑豬肝臟組織在液氮中充分研磨，在液氮揮發(fā)完全之前用總RNA 抽提試劑盒，按照試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行總RNA的提取。用日本島津生物儀器公司的DNA/RNA計(jì)算器和甲醛凝膠電泳檢測(cè)RNA 質(zhì)量。

1.2.2 五蓮黑豬IFN-γ基因RT-PCR的擴(kuò)增 以抽提的總RNA為模板，以O(shè)ligo dT為反轉(zhuǎn)錄引物，按照TOYOBO公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。產(chǎn)物-20℃保存。

以cDNA為模板，擴(kuò)增五蓮黑豬IFN-γ基因。反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer 2.5μl，dNTP 2ml，上、下游引物(10 pmol/μl) 各1μl，Taq酶0.3ml，cDNA模板1ml，加滅菌蒸餾水至25ml。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min、56℃退火40s、72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸6min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10μl進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以檢查擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建轉(zhuǎn)化及其鑒定 將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物回收，與pMD-18T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化利用CaCl2法制備的感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，在Amp/X-gal/IPTG選擇性LB固體培養(yǎng)基中篩選藍(lán)白斑，選取白斑在液體LB培養(yǎng)基中搖菌12h。取1μl菌液，利用與1.2.2相同的條件做PCR鑒定。

1.2.4 測(cè)序 將新鮮菌液送Takara生物公司測(cè)序，ABI PRISM BigDyeTM Terminator Cycle sequence Ready Reaction試劑盒和ABI PRISMTM 377XL測(cè)序儀，測(cè)通全序列。

1.2.5 測(cè)序結(jié)果分析 序列的同源性分析采用動(dòng)態(tài)規(guī)劃的方法，選用CLUSTALW軟件分析，序列的電荷分布，疏水性，重復(fù)結(jié)構(gòu)及周期性分析選用SAPS(Statistical Analysis of Protein Sequences)統(tǒng)計(jì)分析軟件，局部序列的等電點(diǎn)采用ComputepI/MW程序計(jì)算。

1.3 三維結(jié)構(gòu)分析及蛋白的同源建模

搜索自瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)提供的swiss pro Modeling建模服務(wù)器，通過(guò)所提交的序列信息在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)庫(kù)中搜尋模板，在swiss-pdb viewer中通過(guò)人工方法對(duì)局部結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整，采用蛋白質(zhì)三維圖像軟件Swiss-Pdb Viewer根據(jù)距離平方和最小的疊合方法(Least squares superposition)，將蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行疊合。

2 結(jié)果

圖1 五蓮黑豬IFN-γ基因RT-PCR產(chǎn)物電泳分析

M：DNA Maker DL2000；

1：RT-PCR產(chǎn)物

圖2 陽(yáng)性克隆菌液的PCR產(chǎn)物的電泳分析

M：DNA Maker DL2000；

1,2：陽(yáng)性克隆菌液的產(chǎn)物

2.1 五蓮黑豬IFN-γ基因RT-PCR的擴(kuò)增

根據(jù)設(shè)計(jì)的引物對(duì)五蓮黑豬肝臟中的總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖1，擴(kuò)增產(chǎn)物位于500~750bp之間。

2.2 陽(yáng)性重組質(zhì)粒的篩選與鑒定

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，在Amp/X-gal/IPTG選擇性LB固體培養(yǎng)基中篩選藍(lán)白斑。取1μl陽(yáng)性克隆的菌液進(jìn)行PCR鑒定(如圖3)，初步證明克隆成功。

2.3 五蓮黑豬IFN-γ基因序列測(cè)定結(jié)果

將鑒定后的重組克隆培養(yǎng)后由博亞公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)定的結(jié)果表明，五蓮黑豬IFN-γ基因cDNA為662bp，含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框(ORF)，共編碼166個(gè)氨基酸。測(cè)得的序列及推導(dǎo)的氨基酸序列如圖3。

圖3 五蓮黑豬IFN-γ基因cDNA序列及推知的氨基酸序列

2.4 五蓮黑豬IFN-γ蛋白同源建模

通過(guò)距離平方和最小的疊合方法進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到五蓮黑豬IFN-γ的空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)分子結(jié)構(gòu)具有2個(gè)結(jié)構(gòu)域：氨基末端結(jié)構(gòu)域和羧基末端結(jié)構(gòu)域。如圖4。

圖4 五蓮黑豬IFN-γ蛋白同源建模分析圖

3 討論

首次測(cè)定和分析了五蓮黑豬IFN-γ基因，分析證明這種基因的特征與其它物種IFN-γ基因的特征基本一致，在以后的實(shí)驗(yàn)中將繼續(xù)進(jìn)行有關(guān)五蓮黑豬抗病性能、免疫和遺傳方面的研究。（1）本研究中克隆的五蓮黑豬的IFN-γ基因序列與Gen-Bank上登載的豬的序列基因基本一致，無(wú)變異，說(shuō)明同一物種的IFN-γ基因具有極高的保守性。豬IFN-γ基因的開(kāi)放閱讀框編碼由166個(gè)氨基酸組成的前體蛋白，成熟的豬IFN-γ含143個(gè)氨基酸殘基，推測(cè)其分子質(zhì)量為17ku。此外，不同物種之間具有很高的同源性，表明在部分物種之間IFN-γ在基因方面有著極高的相似性。（2）養(yǎng)豬業(yè)在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)著相當(dāng)重要的地位，但是豬的一些烈性傳染病，尤其是病毒病嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。研究表明，IFN-γ是一種高活性、多功能的生物活性糖蛋白，具有強(qiáng)烈的免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)寄生在細(xì)胞內(nèi)的各種病原體均具有抑制作用。無(wú)論作為疫苗佐劑或其他類型的生物制劑，IFN-γ均可明顯提高機(jī)體抗感染能力。但在通常情況下，機(jī)體內(nèi)IFN-γ表達(dá)量甚微，不可能直接提取純化。因此，應(yīng)用IFN-γ作為疫苗佐劑或抗病毒性藥物，必須通過(guò)基因工程技術(shù)體外生產(chǎn)重組IFN-γ，本研究對(duì)五蓮黑豬IFN-γ基因的克隆為此打下了基礎(chǔ)。

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（2011–09–13）

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1007-1733(2011)12-0003-03