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泥蚶血淋巴抗菌活性分析

王雪鵬 張 鑫 張 玲 （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 泰安 271018）繆宇平*（農(nóng)業(yè)部海洋與河口漁業(yè)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 上海）

以泥蚶為試驗(yàn)材料，分別用活的和滅活的副溶血弧菌通過(guò)浸泡方式誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，并以副溶血弧菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌為指示菌進(jìn)行抗菌活性測(cè)定。結(jié)果表明：(1)活的和滅活的副溶血弧菌誘導(dǎo)條件對(duì)泥蚶血淋巴的抗菌活性影響不顯著(P>0.05)，但比對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；(2)血淋巴對(duì)副溶血弧菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌有抑菌作用，尤其是副溶血弧菌和白色念珠菌。

泥蚶 血淋巴 抗菌活性

泥蚶，隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)、瓣鰓綱、列齒目、蚶科、泥蚶屬，是一種棲息于沿海灘涂的廣溫性雙殼貝類，主要分布于西太平洋、印度洋和大西洋海域的中國(guó)、韓國(guó)、泰國(guó)、菲律賓以及馬來(lái)西亞等國(guó)家，在我國(guó)分布于山東半島以南沿海，是山東、浙江、福建和廣東等省重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類(王日昕等, 2005)。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，泥蚶細(xì)菌病也頻繁暴發(fā)，對(duì)泥蚶養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害。近幾十年來(lái)，很多報(bào)道證明抗生素是治療細(xì)菌病的一種重要手段，然而又會(huì)引起水產(chǎn)品抗生素殘留、細(xì)菌耐藥性等問(wèn)題。為了更好預(yù)防和控制細(xì)菌感染，必須發(fā)展一種生物方法(例如抗菌肽)來(lái)控制。

抗菌肽，也稱為肽類抗生素，是一類小分子短肽，具有抗菌力強(qiáng)、抗菌譜廣、活性穩(wěn)定、可以中和細(xì)菌內(nèi)毒素、很難產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)?？咕氖荁oman等人在1981年首次從惜古比天蠶中發(fā)現(xiàn)的，命名為天蠶素。之后國(guó)內(nèi)外許多研究者相繼在其他生物如昆蟲(chóng)(Rees et al，1997)、哺乳動(dòng)物(王莉莉等, 2004)、兩棲動(dòng)物(Lai et al，2002b)、植物(Asiegbu et al，2003)以及微生物(劉潁等, 1999)中均發(fā)現(xiàn)抗菌物質(zhì)，表明抗菌肽廣泛存在于細(xì)菌、植物、脊椎和無(wú)脊椎動(dòng)物中，是先天免疫系統(tǒng)中的重要因子。至今報(bào)道的抗菌肽已經(jīng)超過(guò)500種(洪旭光等, 2004)。

近10年對(duì)抗菌肽的研究已深入到分子結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、基因的表達(dá)與調(diào)控等方面，但對(duì)貝類抗菌肽的研究卻非常少，目前，泥蚶(Jianmin Zhao et al，2007)、貽貝(仲燕等, 2005)、牡蠣(M. Gonzalez et al，2007)等養(yǎng)殖貝類的某個(gè)抗菌肽及其生物學(xué)活性進(jìn)行初步研究。本研究主要探討活的和滅活的副溶血弧菌對(duì)泥蚶血淋巴抗菌物質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與菌株

試驗(yàn)動(dòng)物：成年泥蚶，采自浙江溫州海域，以潔凈海水在通氧條件下養(yǎng)于恒溫(18~20℃)水族箱。試驗(yàn)菌株：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、和副溶血弧菌由浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所閆茂倉(cāng)惠贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 副溶血弧菌誘導(dǎo)物的制備 試驗(yàn)菌株接種于ZoBell 2116E瓊脂培養(yǎng)基斜面上，30℃培養(yǎng)24h，生理鹽水洗下菌苔，2000r/min離心10min，去上清液，沉淀再用生理鹽水洗3次，配成濃度為3×1011CFU/ml的菌懸液，0.1MPa滅菌20min或不滅菌，分別用于滅活菌和活菌免疫誘導(dǎo)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組 成年泥蚶3000只，隨機(jī)分成3組，A組用濃度為3×108CFU/ml滅活的副溶血弧菌處理，B組用濃度為3×108CFU/ml活的副溶血弧菌處理，C組不處理。

1.2.3 血淋巴的采集 分別在誘導(dǎo)處理后的第1、2、4、8、16和24h，用無(wú)菌注射器從供試貝類體內(nèi)采集血淋巴，每組采集150只，血樣混合后，5 000r/min低溫(4℃)離心10min，取上清液，經(jīng)0.22μm孔徑無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾備用。按同樣方法從未經(jīng)誘導(dǎo)處理的貝類體內(nèi)采集血淋巴作為對(duì)照血淋巴。

1.2.4 抗菌活性測(cè)定 每毫升含106細(xì)菌的菌液100μl均勻涂布于固體細(xì)菌培養(yǎng)基表面，將經(jīng)過(guò)滅菌的0.5cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加一定量的泥蚶血淋巴，于30℃培養(yǎng)10~20h，觀察抑菌圈形成與否，并測(cè)定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

血淋巴對(duì)副溶血弧菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的抑菌結(jié)果見(jiàn)表1。從表1得知，泥蚶在誘導(dǎo)前其血淋巴中含有對(duì)抑菌活性物質(zhì)，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后對(duì)這兩種菌的抑菌活性有明顯的提高，誘導(dǎo)后16~24h后對(duì)指示菌的抑菌活性最強(qiáng)，其后一直保持較高的抑菌活性。活菌的誘導(dǎo)效果比滅活菌的誘導(dǎo)效果略好。

表1 誘導(dǎo)前后泥蚶血淋巴的抑菌活性比較 (mm)

3 討論

魏玉西等報(bào)道，在軟體動(dòng)物中，缺乏抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，因而它不能通過(guò)接種抗原來(lái)達(dá)到產(chǎn)生免疫抗體的自我保護(hù)的目的。但是，可以通過(guò)提高貝類的非特異免疫防御系統(tǒng)來(lái)增強(qiáng)貝類的抗病力。本試驗(yàn)中，通過(guò)誘導(dǎo)可使泥蚶血淋巴的抑菌活性增強(qiáng)，說(shuō)明泥蚶的非特異性免疫因子存在一定程度的可誘導(dǎo)性。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，可通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄕT導(dǎo)泥蚶產(chǎn)生更強(qiáng)的抗病力。

目前，研究者發(fā)現(xiàn)貝類的抗菌物質(zhì)主要有防御素、貽貝素、貽貝肽、貽貝霉素等多種抗菌物質(zhì)，分別對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌、真菌等有抗菌效果。但與其它生物(如昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、植物以及微生物)抗菌肽的研究相比，在種類和研究深度上還有很大差距。

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本課題由農(nóng)業(yè)部海洋與河口漁業(yè)資源及生態(tài)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助(開(kāi)-09-12)

（2011–11–19）

Q959.215

A

1007-1733(2011)12-0001-02