萬慶家，饒高雄，鴨 喬，張秋玲，龍 祥

1云南綠A生物工程有限公司，昆明650106;2云南中醫(yī)學(xué)院，昆明650500

β-環(huán)糊精包合雨生紅球藻皂化產(chǎn)物可行性研究

萬慶家1*，饒高雄2，鴨 喬1，張秋玲1，龍 祥1

1云南綠A生物工程有限公司，昆明650106;2云南中醫(yī)學(xué)院，昆明650500

本文以雨生紅球藻皂化產(chǎn)物中蝦青素含量為評價(jià)指標(biāo)，對β-環(huán)糊精包合雨生紅球藻皂化產(chǎn)物可行性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)雨生紅球藻粉在優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)條件下皂化產(chǎn)物經(jīng)β-環(huán)糊精包合后，HPLC檢測主要成分組成未見明顯變化，包合率可達(dá)到90%。于溫度40℃，濕度75%條件下進(jìn)行穩(wěn)定性加速實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，經(jīng)皂化后包合物中蝦青素穩(wěn)定性較好，達(dá)到了藥物和保健食品原料的穩(wěn)定性要求，說明該方法可行。

雨生紅球藻;蝦青素;皂化;β-環(huán)糊精;包合率;穩(wěn)定性

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門(Chlorophyta)，綠藻綱(Chlorophyceae)，團(tuán)藻目(Volvocales)，紅球藻科(Haematococcaceae)，紅球藻屬(Haematococcus)，是蝦青素的天然來源中含量最高的，高達(dá)細(xì)胞干重的1.0%～3.0%。雨生紅球藻粉生成的類胡蘿卜素中70%為蝦青素單酯，10%為蝦青素二酯，5%的游離蝦青素，以及15%的β-胡蘿卜素，角黃素，葉黃素，及其他類胡蘿卜素［1，2］。雨生紅球藻中蝦青素結(jié)構(gòu)類型以全反式為主，含有少量的順式結(jié)構(gòu)。

蝦青素(Astaxanthin，3，3-二羥基-8，3'-胡蘿卜素4，4-二酮)屬于酮式類胡蘿卜素，它由8個(gè)異戊二烯單位構(gòu)成，是一種多萜類不飽和化合物，其顯著的效果包括改進(jìn)關(guān)節(jié)健康、防護(hù)陽光傷害、預(yù)防老年性黃斑變性、預(yù)防某些癌癥、增強(qiáng)免疫力等，在食品添加劑、化妝品、保健品和醫(yī)藥工業(yè)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景［3，4］。

趙立艷等人測定了雨生紅球藻提取物皂化前后的抑制油脂過氧化能力、清除DPPH·自由基能力和還原力，結(jié)果表明雨生紅球藻提取物皂化前后在三種評價(jià)方法中都表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化活性［5］。人體實(shí)驗(yàn)表明:血清中未檢測出蝦青素酯，表明蝦青素酯在吸收后迅速水解，綜上所述，蝦青素在人體內(nèi)以游離態(tài)形式存在并發(fā)揮作用。

由于蝦青素中含有一個(gè)長的共軛雙鍵系統(tǒng)，比其他異戊二烯化合物更不穩(wěn)定，光、熱、酸和氧作用均易破壞蝦青素的結(jié)構(gòu)，所有的研究資料和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，無論是破壁后的雨生紅球藻粉，還是其提取物，均需要低溫避光真空保存，甚至需要冷凍避光真空保存，嚴(yán)重限制了它的廣泛應(yīng)用，因此，提高蝦青素穩(wěn)定性是一個(gè)急需解決的關(guān)鍵問題。

文中采用環(huán)糊精包合技術(shù)對蝦青素進(jìn)行包合，以提高蝦青素穩(wěn)定性及利用率，但由于雨生紅球藻粉蝦青素提取物中含有一定量的脂肪，對包合效果影響很大，使包合率大大降低，文中通過皂化降低提取液中脂肪含量，達(dá)到改變蝦青素在水中的溶解度、起到了抗氧化、抗光和熱的作用，增加了藥物的穩(wěn)定性能、并拓寬藥物可開發(fā)的劑型和可利用范圍(飲料和化妝品)，為進(jìn)一步開發(fā)天然的蝦青素產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

ER-82B型分析天平:日本A＆D公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;CF7D2型離心機(jī):江西華科精密儀器有限公司; Agilent 1100高效液相色譜儀;NF1001V/CCA-1110/ A-3S型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:日本EYELA公司;RW20型攪拌機(jī):德國IKA公司;ALPHA1-4型冷凍真空干燥器:德國CHRIST公司;CQ-25-12型超聲波清洗器:中科先達(dá)超聲電子有限公司。

1.1.2 材料及溶液配制

雨生紅球藻粉(破壁處理):由云南綠A生物工程有限公司提供;BHT(Butylated Hydroxytoluene;2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚)、β-環(huán)糊精:上海伯奧生物科技有限公司，藥用級;KOH、甲醇、乙醇、三氯甲烷等均為分析純;丙酮:色譜純。氮?dú)?氮?dú)夂俊?8.5%;全反式蝦青素對照品(99.8%):瑞士SIGMA公司購買。

三氯甲烷-BHT溶液(0.5 g/L):取0.5 g BHT溶于1 L三氯甲烷(分析純)，搖勻即得。

甲醇制氫氧化鉀溶液(0.1 mol/L):取5.6 g氫氧化鉀用適量純化水使溶解，用甲醇定容至1 L，即得。

1.2 雨生紅球藻粉皂化方法［6，7］

取雨生紅球藻粉(HPLC 2.5%)2.0 g，置于250 ml三角瓶中，加入三氯甲烷-BHT溶液80 ml避光充氮?dú)猓?0℃水浴鍋中放置10 min，過濾，濾渣按上述操作反復(fù)幾次，至濾液基本無色;合并濾液至500 mL棕色容量瓶中。加入100 mL 0.2 mol/L氫氧化鉀/甲醇溶液，用三氯甲烷-BHT溶液定容至刻度，搖勻后充氮保護(hù)，同時(shí)用自封膠帶密封，置4℃環(huán)境中避光擺放12 h，取出傾倒于1.5 L分液漏斗中，加水500 mL輕搖分液漏斗數(shù)次混懸均勻，靜置分層，下層液同法再萃取一次后，合并濾液至500 mL棕色容量瓶中定容即得。

1.3 UV法檢測總蝦青素含量及皂化過程中總蝦青素保存率計(jì)算方法

精密稱取0.03 g藻粉于離心試管中，加5 mL丙酮溶液振搖溶解，置50℃恒溫水浴鍋中振搖提取10 min。再在轉(zhuǎn)速為3500 r/min下離心2 min，取上清液移至25 mL容量瓶中。再向離心試管中加入5 mL丙酮溶液重復(fù)上述操作直到樣品變?yōu)榛野咨珪r(shí)，合并提取液用丙酮定容至刻度，搖勻，取1 mL至10 ml容量瓶中，用丙酮定容至刻度，搖勻即得。取供試品溶液于1 cm玻璃比色皿中，于474 nm波長處測定吸光度，計(jì)算總蝦青素含量。皂化產(chǎn)物濃縮回收氯仿后，用丙酮溶解定容后按上述方法檢測。

皂化反應(yīng)中總蝦青素保存率(%)=皂化產(chǎn)物中總蝦青素含量×所得皂化產(chǎn)物重量/皂化前藻粉總蝦青素質(zhì)量×100%

1.4 β-環(huán)糊精包合物的制備

將1.2所得溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中室溫濃縮至干膏后，加入5 mL乙醇溶解。另稱取β-環(huán)糊精10 g于燒杯中，加水50 ml，在50℃條件下攪拌使全部溶解后，將雨生紅球藻的皂化產(chǎn)物乙醇溶液滴加至β-環(huán)糊精水溶液中，恒溫?cái)嚢? h，攪拌轉(zhuǎn)速在600 r/ min左右，試驗(yàn)過程中保持避光，溶液通氮?dú)獗Ｗo(hù)。然后冷卻至室溫，置冰箱內(nèi)冷藏24 h，抽濾，并先后用適量蒸餾水快速洗滌，40℃真空干燥，研碎，即得雨生紅球藻的皂化產(chǎn)物β-環(huán)糊精包合物。

1.5 HPLC檢測全反式蝦青素的含量

精密吸取10 mL 1.2項(xiàng)下所得溶液轉(zhuǎn)移至25 mL棕色容量瓶中，加入三氯甲烷-BHT定容，搖勻后HPLC檢測。以下步驟需要在避光條件下進(jìn)行，試驗(yàn)環(huán)境溫度不宜超過25℃，樣品處理過程均需氮?dú)獗Ｗo(hù)。色譜條件色譜柱:YMC-Pack ODS-A 250× 4.6 mm L.D S-5 μm;流動(dòng)相:其中以丙酮為流動(dòng)相A、以水為流動(dòng)相B，梯度洗脫。流速:0.8 mL/min;波長:476 nm;柱溫:20℃。進(jìn)樣量:20 μL。

1.6 包合物中全反式蝦青素含量的測定及包合率計(jì)算

精密稱取包合物0.2 g置于錐形瓶中，加5 mL水溶解后，加入三氯甲烷-BHT 5 mL，搖勻，置超聲波清洗器中處理10 min，使蝦青素轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中，如此反復(fù)數(shù)次，直至水相變?yōu)闊o色為止。將有機(jī)相合并、無水Na2SO4脫水后，HPLC檢測。按下列公式計(jì)算包合率。

包合率(%)=微囊中蝦青素含量×所得微膠囊重量/包合前蝦青素質(zhì)量×100%

1.7 包合物中全反式蝦青素的穩(wěn)定性試驗(yàn)

取適量包合物樣品于稱量瓶中，于溫度40℃，濕度75%條件下置于加速穩(wěn)定性試驗(yàn)箱內(nèi)進(jìn)行穩(wěn)定性加速試驗(yàn)，分別于第0、1、2、3月測定蝦青素含量，與原始含量相比得全反式蝦青素殘存率。同時(shí)用雨生紅球藻粉樣品做對照試驗(yàn)，用HPLC法檢測蝦青素含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 皂化反應(yīng)前后成分對比分析

全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜(保留時(shí)間為6.758 t)見圖1:

圖1 全反式蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜Fig.1 The HPLC chromatogram of tran-astaxanthin standard

皂化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)雨生紅球藻粉在實(shí)驗(yàn)條件下，皂化基本完全后產(chǎn)物主要為全反式蝦青素(保留時(shí)間為6.758 t)，同時(shí)含有少量未皂化蝦青素酯以及少量其他構(gòu)型的游離蝦青素，如圖2所示:

圖2 雨生紅球藻皂化產(chǎn)物HPLC圖譜Fig.2 The HPLC chromatogram of saponification of H.pluvialis

而雨生紅球藻粉的蝦青素皂化前絕大部分以酯的形式存在，HPLC色譜圖如圖3所示:

2.1.2 包合前后成分對比分析

試驗(yàn)結(jié)果表明，雨生紅球藻粉皂化產(chǎn)物在適當(dāng)?shù)陌蠗l件下得到的包合物，其HPLC圖譜構(gòu)成與比例與包合前基本一致，未見明顯改變，主要成分仍是全反式蝦青素。

圖3 雨生紅球藻粉HPLC圖譜Fig.3 The HPLC chromatogram of powder of H.pluvialis

2.1.3 皂化過程中總蝦青素保存率試驗(yàn)結(jié)果

按1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行皂化試驗(yàn)，按1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測計(jì)算，結(jié)果如下表1所示，3個(gè)批次雨生紅球藻粉皂化前后總蝦青素平均保存率為92.3%。

表1 皂化過程中總蝦青素保存率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of survival rate of astaxanthin within saponification

表2 包合過程中全反式蝦青素包合率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of inclusion rate of tran-astaxanthin within inclusion

2.1.4 包合過程中全反式蝦青素包合率試驗(yàn)結(jié)果

使用3個(gè)批次雨生紅球藻粉，按1.2項(xiàng)下方法進(jìn)行皂化反應(yīng)后，按1.4項(xiàng)下方法進(jìn)行包合試驗(yàn)，按1.5項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測定，按1.6項(xiàng)下方法進(jìn)行包合率計(jì)算，結(jié)果如下表2所示，雨生紅球藻粉皂化產(chǎn)物包合前后全反式蝦青素平均包合率為91.0%。

2.1.5 包合物中蝦青素的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

按1.7項(xiàng)方法操作，結(jié)果如圖4所示，3個(gè)批次雨生紅球藻粉三個(gè)月后平均殘存率為52.6%，3批次皂化包合物三個(gè)月后平均殘存率為95.0%，包合后雨生紅球藻皂化提取物比原粉蝦青素殘存率(%)提高了42.4%，蝦青素-環(huán)糊精包合物可大大提高蝦青素在保存期間的穩(wěn)定性，達(dá)到了藥物和保健食品原料的穩(wěn)定性要求。

圖4 全反式蝦青素保存率趨勢圖Fig.4 The trend graph of survival rate of tran-astaxanthin

3 結(jié)論

3.1 雨生紅球藻粉含有游離蝦青素和蝦青素酯，由于結(jié)合成酯的脂肪酸不同，蝦青素酯種類繁多、存在形態(tài)各異，在氮?dú)獗Ｗo(hù)、低溫、避光、抗氧化劑(BHT)保護(hù)條件下，雨生紅球藻粉中的蝦青素酯在一定濃度的堿性溶液中皂化水解成游離蝦青素，皂化水解過程沒有明顯破壞蝦青素的結(jié)構(gòu)與構(gòu)型。

3.2 皂化反應(yīng)能提高蝦青素β-環(huán)糊精包合物的包合率，主要是因?yàn)橥ㄟ^皂化反應(yīng)有效去除雨生紅球藻中的油脂，另外皂化反應(yīng)將原來的蝦青素酯水解成游離的蝦青素，降低了分子的空間體積和分子量大小，更加符合了包合的要求。

3.3 皂化條件為:溫度4℃，氫氧化鉀/甲醇溶液0.2 mol/L，每克雨生紅球藻粉加入50 mL氫氧化鉀/甲醇溶液，反應(yīng)時(shí)間12 h。在此條件下，總蝦青素保存率可達(dá)90%以上。

3.4 包合條件為:在50℃條件下，2 g紅球藻皂化提取物乙醇溶液與10 g β-環(huán)糊精水溶液恒溫?cái)嚢璋?小時(shí)，包合率可達(dá)90%以上。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，將雨生紅球藻粉皂化后制成蝦青素-環(huán)糊精包合物可大大提高蝦青素在保存期間的穩(wěn)定性，而且皂化后包合物穩(wěn)定性與原粉相比顯著提高，達(dá)到了藥物和保健食品原料的穩(wěn)定性要求。

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Feasibility Study on Inclusion Complex of Saponification Product of Haematococcus pluvialis with β-Cyclodextrin

WAN Qing-jia1*，RAO Gao-xiong2，YA Qiao1，ZHANG Qiu-ling1，LONG Xiang11Yunnan Green A Biological Project Co.，Ltd，Kunming 650106，China;2Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China

Feasibility on inclusion complex of saponification product of Haematococcus pluvialis with β-cyclodextrin was studied with astaxanthin content as the quality evaluation criteria.As the results，inclusion rate reached 90%at optimized conditions，and the content of astaxanthin in the saponification of H.pluvialis have no significant change.The stability of astaxanthin reach the requirements as medicine and health food raw materials in the accelerative experiment of stability at 50℃，75%relative humidity.The results showed that this method is feasible.

Haematococcus pluvialis;astaxanthin;saponification;β-cyclodextrin;inclusion rate;stability

1001-6880(2011)04-0700-04

2010-06-12 接受日期:2010-10-28

科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金無償資助項(xiàng)目:新型生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)紅球藻生產(chǎn)蝦青素技術(shù)研究與開發(fā)(09C26215302506)

*通訊作者 Tel:86-871-8325916;E-mail:wanqingjia163@163.com

O641.4;R943

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