宋長城，呂 祥，程彬彬，李 柏，凌昌全

血管新生與腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［1］。在腫瘤血管生成過程中，腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互依賴生存［2］。血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的各種生長因子對腫瘤生長具有旁分泌作用。同時，腫瘤細(xì)胞又可分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生存和增殖所需要的有絲分裂原和動力原。肝細(xì)胞癌 (hepatocarcinoma，HCC)是典型的富血管惡性腫瘤，血管新生化與其生長、浸潤、轉(zhuǎn)移、分期及預(yù)后有著密切聯(lián)系。因此，阻斷HCC血供的方法有望成為今后 HCC治療的突破口［3］。蜂毒素 (Melittin，Mel)是從傳統(tǒng)中藥蜂毒中提取的一種小分子肽類物質(zhì)。既往研究發(fā)現(xiàn)［4-5］，它對多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有較強的抑制作用，是一個十分具有應(yīng)用前景的抗腫瘤天然藥物。但有關(guān)Mel抑制腫瘤細(xì)胞合成和分泌促血管生成因子方面的研究鮮有報道。我們觀察了Mel對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402的增殖抑制作用，以及對其分泌促血管生長因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Mel(美國 Sigma公司，批號:104K4016);RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);小牛血清 (杭州四季青公司);MTT(美國Sigma公司);兔抗人VEGF多克隆抗體和bFGF多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(美國GenScript公司);SABC免疫組化試劑盒(武漢BOSTER公司);人VEGF和FGF-basic定量ELISA試劑盒(美國R＆D systems公司);經(jīng)典總RNA提取試劑盒、β-actin、VEGF和 bFGF引物(上海Sangon生物工程公司);Real-time PCR反應(yīng)試劑盒(德國Roche公司)。

1.1.2 儀器 XDS-1B型倒置相差顯微鏡(Olympus，日本);Rotor-Gene RG-3000型熒光定量 PCR儀(Corbet Research，澳大利亞);Modle 500型酶聯(lián)免疫檢測儀 (Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株BEL-7402購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下，于10% 小牛血清、100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)基中傳代，實驗用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.2 MTT法檢測藥物體外抗腫瘤作用 取對數(shù)生長期BEL-7402細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔1×107·L-1接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后換液，分別加入濃度為 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg·L-1Mel的培養(yǎng)基100 μl，同時設(shè)陰性對照組 (在含細(xì)胞的培養(yǎng)孔內(nèi)加等量培養(yǎng)基)和空白對照組 (不接種細(xì)胞，僅加等量培養(yǎng)基)。每組設(shè)6個復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)，分別在 24、48、72 h每孔加入 5 g·L-1MTT溶液 10 μl，孵育 4 h后吸去培養(yǎng)基，再加入150 μl DMSO于振蕩器上振蕩，待藍(lán)色晶體完全溶解后，在酶標(biāo)儀上測定A492nm值，并且計算增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF和bFGF含量 取對數(shù)生長期 BEL-7402細(xì)胞，以1×104·L-1接種于96孔板，細(xì)胞生長達(dá)飽和狀態(tài)后更換為無血清培養(yǎng)基，同步培養(yǎng)12 h，分別加入含有終濃度為 2.0、4.0、8.0 mg·L-1Mel培養(yǎng)基，同時設(shè)立空白對照組，作用 24 h后，收集上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行 VEGF和 bFGF含量檢測。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測VEGF和bFGF蛋白表達(dá) 生長良好的BEL-7402細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后接種于放有無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞生長達(dá)飽和狀態(tài)后，分別加入含有終濃度為 2.0、4.0、8.0 mg·L-1Mel培養(yǎng)基，同時設(shè)空白對照組，作用24 h后取出蓋玻片，PBS液沖洗，4% 多聚甲醛固定，按SABC免疫組化試劑盒方法進(jìn)行。結(jié)果判定:以胞質(zhì)呈棕黃染色為陽性細(xì)胞。結(jié)果采用IMS程序軟件分析，每張爬片隨機選取3個視野，通過預(yù)設(shè)采樣程序得出陽性面積和平均光密度值，以陽性面積比與平均光密度值的乘積為免疫細(xì)胞化學(xué)陽性指數(shù) (positive index，PI)。每組設(shè)立3個復(fù)孔。

1.2.5 實時熒光定量PCR法檢測VEGF mRNA和bFGF mRNA的表達(dá) 分別收集經(jīng)終濃度為 2.0、4.0、8.0 mg·L-1Mel作用 24 h后的 BEL-7402細(xì)胞，同時設(shè)立空白對照組。按照試劑盒說明提取細(xì)胞總 RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，根據(jù) Light Cycler DNA Master SYBR GreenⅠ說明書進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。PCR引物序列見Tab 1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:模板 2 μl，上、下游引物各 1 μl，SybGreen PCR master mix 10 μl，dd H2O 6 μl，總反應(yīng)體積為 20 μl。反應(yīng)條件:94℃ 預(yù)變性 3 min，94℃ 變性 20 s，54℃退火20 s，72℃ 延伸25 s，共40個循環(huán)。最后72℃延伸10 min。在 65℃ ～95℃ 區(qū)間內(nèi)進(jìn)行溶解實驗，并繪制溶解曲線。目標(biāo)基因表達(dá)相對定量分析采用 2-△△CT法［6］。

Tab 1 The sequences of primers

2 結(jié)果

2.1 Mel對BEL-7402細(xì)胞的增殖抑制作用 Mel在0.5～16 mg·L-1濃度范圍內(nèi)對人肝癌細(xì)胞BEL-7402的增殖呈濃度-時間依賴性的抑制作用，見 Fig 1。Mel作用24、48和72 h后的 IC50分別為6.80、5.47 和 4.87 mg·L-1。

Fig 1 Inhibitory effects of Mel on the proliferation of BEL-7402 cells( ± s，n=6)

2.2 Mel對BEL-7402細(xì)胞分泌 VEGF和 bFGF的影響 與空白對照組比較，經(jīng)Mel作用24 h后，BEL-7402細(xì)胞上清液中 VEGF及 bFGF含量明顯降低 (P＜0.05或P＜0.01)，并表現(xiàn)出濃度依賴性的特點，見 Tab 2。

Tab 2 Effects of Mel on the expression of VEGF and bFGF in BEL-7402 cells detected by ELISA±s，n=6)

Tab 2 Effects of Mel on the expression of VEGF and bFGF in BEL-7402 cells detected by ELISA±s，n=6)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control

Group Dose/mg·L-1 Level of protein expression/μg·L-1 VEGF bFGF Control 242.54±3.96 19.04±1.25 Mel 2.0 209.95±8.30＊＊ 13.79±1.24*4.0 181.89±13.30＊＊ 11.14±0.24＊＊8.0 163.48±6.19＊＊ 10.18±1.97＊＊

2.3 Mel對BEL-7402細(xì)胞VEGF和 bFGF蛋白表達(dá)的影響 Fig 2所示，空白對照組VEGF和 bFGF蛋白在BEL-7402細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)呈強陽性。經(jīng)軟件分析，其VEGF和bFGF蛋白陽性表達(dá)指數(shù)分別為1.3662±0.1358和1.2725±0.1793;而Mel各組VEGF和bFGF表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，染色變淡，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或 P＜0.01)，且Mel對兩種蛋白表達(dá)的下調(diào)作用呈濃度依賴性，見 Tab 3。

Fig 2 Effects of Mel on the expression of VEGF and bFGF in BEL-7402 cells(×100)A:VEGF control;B:VEGF 8.0 mg·L-1;C:bFGF control;D:bFGF 8.0 mg·L-1

Tab 3 Effects of Mel on the expression of VEGF and bFGF in BEL-7402 cells detected by immunocytochemical staining±s，n=3)

Tab 3 Effects of Mel on the expression of VEGF and bFGF in BEL-7402 cells detected by immunocytochemical staining±s，n=3)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control

Group Dose/mg·L-1 Positive index of protein expression VEGF bFGF Control 3.8013±0.6039 4.4320±0.3361 Mel 2.0 2.5929±0.2689* 2.4455±0.7795*4.0 2.6077±0.1657* 2.2733±0.3557*8.0 1.5458±0.2166* 2.0986±0.2707*

2.4 實時熒光定量 PCR檢測BEL-7402細(xì)胞中VEGF mRNA和bFGF mRNA的表達(dá) 與空白對照組比較，Mel各濃度組VEGF mRNA和bFGF mRNA的表達(dá)明顯降低 (P＜0.01)。Mel低、中、高濃度組 VEGF mRNA的表達(dá)分別是空白對照組的0.66、0.52和0.22倍，而 bFGF mRNA的表達(dá)分別是空白對照組的0.51、0.36和0.34倍，見 Fig 3。

3 討論

自1971年Folkman首次提出腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有血管依賴性之后，抗腫瘤血管生成得到廣泛關(guān)注。腫瘤血管生成是指血管內(nèi)皮細(xì)胞從現(xiàn)有的血管系統(tǒng)中分化、遷移而形成新的微血管的復(fù)雜生物學(xué)過程。有多種生長因子、胞外基質(zhì)成分、蛋白水解酶和細(xì)胞黏附分子參與了該過程［7］。它是血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境相互作用的結(jié)果。血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的各種生長因子對腫瘤具有旁分泌作用，同時，腫瘤細(xì)胞又可分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖所需要的有絲分裂原和動力原。因此，在腫瘤治療中，有效抑制腫瘤細(xì)胞合成和分泌促血管生成因子，可拮抗腫瘤血管生成，阻斷其有效血供，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

Fig 3 Effects of Mel on the mRNA of VEGF and bFGF in BEL-7402 cells(±s，n=3)＊＊P＜0.01 vs control

近年來，隨著腫瘤細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，人們試圖尋找抗腫瘤作用明顯、毒副作用小的新型抗腫瘤藥物。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，一些從天然藥物中提取的小分子物質(zhì)具有抑制腫瘤生長、阻礙腫瘤血管生成的作用［8］。Mel是從傳統(tǒng)中藥蜂毒中提取、純化的一種小分子肽類物質(zhì)，它是蜂毒的主要組成成分和活性單位，約占蜂毒干重的50%，由26個氨基酸組成。我們實驗室既往研究表明［9-10］，Mel對骨肉瘤細(xì)胞株 U2OS、人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721、Hep-3B等腫瘤細(xì)胞的增殖具有較強的抑制作用，并可影響腫瘤細(xì)胞周期的正常移行，阻止 S期細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡或壞死。本實驗是在既往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討Mel對人肝癌細(xì)胞株BEL-7402增殖的影響。結(jié)果表明，濃度為 0.5～16.0 mg·L-1的Mel對BEL-7402細(xì)胞的增殖生長具有明顯的抑制作用，并且存在濃度和時間依賴性。

腫瘤的血管生成是一個由多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的多步驟級聯(lián)反應(yīng)過程，其血管生成程度取決于腫瘤細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用［12］。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過自分泌方式，而腫瘤細(xì)胞通過旁分泌方式產(chǎn)生大量促血管生成因子。其中，VEGF和bFGF是最重要的兩個血管生成調(diào)控因子，它們通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，加速新生血管的構(gòu)建［11-12］。本實驗通過 ELISA法和免疫細(xì)胞化學(xué)方法證實了VEGF和bFGF在BEL-7402細(xì)胞中呈高表達(dá)。經(jīng)Mel處理后，BEL-7402細(xì)胞 VEGF和 bFGF的表達(dá)明顯下調(diào)，并且呈濃度依賴性。而實時熒光定量PCR檢測結(jié)果亦顯示，Mel可降低BEL-7402細(xì)胞VEGF mRNA和bFGF mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)作用隨著Mel濃度的升高而增強。這提示，Mel可從基因和蛋白質(zhì)水平影響肝癌細(xì)胞VEGF和bFGF的表達(dá)，抑制其旁分泌功能。

綜上所述，我們研究發(fā)現(xiàn)，Mel可抑制人肝癌細(xì)胞株BEL-7402的增殖生長，并且下調(diào)促血管生成因子VEGF和 bFGF的表達(dá)。該結(jié)果提示，Mel不僅具有直接抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，而且可通過阻礙肝癌細(xì)胞合成和分泌促血管生成因子，干擾其與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，拮抗腫瘤血管生成，抑制腫瘤生長，但其具體分子機制尚待進(jìn)一步研究。

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