羅 萍，杜 松，段紅艷，李海霞

1)河南省人民醫(yī)院心內(nèi)科鄭州 450003 2)河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科鄭州 450003

△女，1977年9月生，碩士，主治醫(yī)師，研究方向:冠心病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail:TJXLLP@163.com

普羅布考對過氧化氫誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激水平的影響*

羅 萍1)△，杜 松1)，段紅艷1)，李海霞2)

1)河南省人民醫(yī)院心內(nèi)科鄭州 450003 2)河南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科鄭州 450003

△女，1977年9月生，碩士，主治醫(yī)師，研究方向:冠心病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail:TJXLLP@163.com

普羅布考;過氧化氫;丙二醛;超氧化物歧化酶;Bax;Bcl-2;凋亡;大鼠;心肌細(xì)胞

目的:探討普羅布考對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響，探討其可能的機(jī)制。方法:培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分組，分別給予0、1、10和100 μmol/L普羅布考預(yù)處理6 h后，再給予0.2 mmol/L H2O2繼續(xù)孵育6 h。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，RT-PCR法檢測細(xì)胞Bcl-2及Bax mRNA的表達(dá)，黃嘌呤氧化酶法測定細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸法檢測細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量。結(jié)果:普羅布考劑量依賴性地抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，降低心肌細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)，升高Bcl-2 mRNA表達(dá)，升高心肌細(xì)胞SOD活性，降低MDA含量。結(jié)論:普羅布考可抑制H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與改善心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平有關(guān)。

心臟受到各種損傷后氧化應(yīng)激水平顯著升高。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致心室重構(gòu)和進(jìn)行性心力衰竭［1］。普羅布考為一種脂溶性強(qiáng)抗氧化劑，能通過細(xì)胞膜浸潤至心肌細(xì)胞內(nèi)，直接清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基。普羅布考可能通過在細(xì)胞內(nèi)外抑制氧化應(yīng)激，影響心肌凋亡調(diào)控基因，從而減輕心肌細(xì)胞的凋亡，保護(hù)心功能［2］。作者觀察了普羅布考對H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 新生1～3 d的Wistar大鼠(鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)。DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司);Trizol裂解液(Invitrogene公司);dNTPs、OligodT18、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、Taq酶(TaKaRa公司)，瓊脂糖(Sigma公司);普羅布考(齊魯制藥廠);H2O2(天津廣成試劑公司);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所); AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)。

1.2 乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 參照Simpson等［3］的方法，采用酶消化法分離心肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。無菌取出新生大鼠心臟，用無菌D-Hanks液漂洗2次，剪除大血管和心房，再用無菌D-Hanks液洗凈心腔血液后，轉(zhuǎn)移至無菌青霉素小瓶中，將心肌組織剪成1 mm3大小的碎塊，加入0.6 g/L胰蛋白酶8～10 mL，37℃低速磁力攪拌消化6～8次，每次10 min，直至組織塊消化完為止。棄去第1次消化上清液，收集此后的每次上清液，加入37℃預(yù)熱的含小牛血清的DEME培養(yǎng)基以中和胰蛋白酶，1 500 r/min離心6 min，棄上清。將沉淀用含體積分?jǐn)?shù)20%小牛血清的DEME培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，經(jīng)貼壁1.5 h除去成纖維細(xì)胞分離純化后，調(diào)整為0.5×109L－1接種于培養(yǎng)瓶中，置體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。隔日更換培養(yǎng)基，3～4 d后，待細(xì)胞融合貼滿瓶底且有節(jié)律同步搏動時，取原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將體外培養(yǎng)的原代大鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組，每組6瓶細(xì)胞。H2O2組加入0.2 mmol/L H2O2，其他3組分別予以1、10和100 μmol/L普羅布考預(yù)處理6 h后，再加入0.2 mmol/L H2O2繼續(xù)孵育6 h。

1.4 觀測指標(biāo)

1.4.1 細(xì)胞凋亡測定 取4組處理后的心肌細(xì)胞用12.5 g/L胰蛋白酶消化，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106L－1，按AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒說明書操作，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，記錄細(xì)胞凋亡率。

1.4.2 心肌細(xì)胞內(nèi)SOD活性及MDA含量測定細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量測定分別按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3 Bax及Bcl-2 mRNA檢測 用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)Bcl-2、Bax和內(nèi)參照基因GAPDH的PCR引物。引物序列及產(chǎn)物長度見表1。取經(jīng)過處理的心肌細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在PCR儀上擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，以目的基因條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

表1 目的基因PCR引物序列及產(chǎn)物長度

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。4組細(xì)胞凋亡率、Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的相對表達(dá)量，細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組心肌細(xì)胞凋亡率測定結(jié)果 經(jīng)不同劑量普羅布考預(yù)處理后，H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率均明顯下降，且細(xì)胞凋亡率隨普羅布考劑量的升高而降低，見表2。

2.2 4組心肌細(xì)胞Bax及Bcl-2 mRNA的表達(dá)與H2O2組相比，不同劑量普羅布考組Bax mRNA的表達(dá)均明顯下降，而Bcl-2 mRNA表達(dá)均明顯升高，且呈劑量依賴性，見圖1及表2。

2.34組心肌細(xì)胞內(nèi)SOD活性及MDA含量測定結(jié)果 與H2O2組相比，普羅布考組細(xì)胞內(nèi)SOD活性均升高，MDA含量均降低，且呈劑量依賴性，見表2。

4組心肌細(xì)胞Bax(上)及Bcl-2(下)mRNA的表達(dá)

表2 普羅布考對心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響

3 討論

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞中促氧化與抗氧化體系之間的平衡失調(diào)而傾向于前者所導(dǎo)致的一種細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂。促氧化作用主要由活性氧來完成?；钚匝醢ㄟ^氧化氫、單態(tài)氧、超氧負(fù)離子及羥基等，它們通過多種途徑損害心肌組織，包括激活基質(zhì)金屬蛋白酶參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑，作為信號分子參與心肌肥厚，誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，損傷內(nèi)皮細(xì)胞和激活炎癥因子生成等［1］。

已有研究［4］證實(shí)活性氧與心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)?；钚匝踔饕ㄟ^線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、P53通路及TNF-α通路引起心肌細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族是與凋亡密切相關(guān)的基因群，它通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性和凋亡蛋白的釋放調(diào)控細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族被分為兩類，一類為前凋亡蛋白，包括Bax、Bad及Bak等，另一類為抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、BCI-XL及BCL-W等［5］。前凋亡蛋白轉(zhuǎn)位到線粒體膜上可促進(jìn)線粒體內(nèi)的凋亡蛋白釋放?？沟蛲龅鞍着c前凋亡蛋白結(jié)合，可阻止其促凋亡作用［6］。在心肌細(xì)胞中，氧化應(yīng)激能使Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)下降，線粒體膜通透性增高，促細(xì)胞發(fā)生凋亡［7］。

Lou等［8］研究顯示普羅布考可抑制阿霉素所致擴(kuò)張型心肌病的心肌細(xì)胞凋亡。Ruixing等［9］研究表明普羅布考可減少兔缺血-再灌注損傷的心肌細(xì)胞凋亡。Oskarsson等［10］及Kumar等［11］發(fā)現(xiàn)普羅布考明顯抑制Bax的表達(dá)而減少心肌細(xì)胞凋亡。該研究結(jié)果顯示，普羅布考預(yù)處理可劑量依賴性地減少H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率及前凋亡蛋白Bax mRNA的表達(dá)，升高抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA的表達(dá)，提示普羅布考可能通過干擾線粒體的致凋亡途徑發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。作者還觀察到普羅布考預(yù)處理可劑量依賴性地減少H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)MDA含量，提高SOD活性。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，是研究抗氧化能力的常用指標(biāo)之一。SOD是生物體內(nèi)清除氧自由基的重要酶類，可減輕氧離子損傷，其活性高低可以間接反映體內(nèi)氧自由基清除能力。這一結(jié)果提示普羅布考能有效降低心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。提示普羅布考可能通過降低氧化應(yīng)激水平，從而抑制了心肌細(xì)胞的凋亡。

總之，該實(shí)驗(yàn)在離體心肌細(xì)胞水平觀察到普羅布考能有效減少H2O2所致的細(xì)胞凋亡，這一效應(yīng)可能部分通過改善心肌氧化應(yīng)激水平，干擾線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來實(shí)現(xiàn)，但作用的具體途徑仍未完全闡明，還需進(jìn)一步探討。

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Inhibition of probucol on cultured neonatal rat cardiomyocyte apoptosis induced by hydrogen peroxide

LUO Ping1)，DU Song1)，DUAN Hongyan1)，LI Haixia2)1)Department of Cardiology，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003 2)Department of Clinical Laboratory，Henan Provincial People’s Hospital，Zhengzhou 450003

probucol;hydrogen peroxide;malondialdehyde;superoxide dismutase;Bax;Bcl-2;apoptosis;rat;cardiomyocyte

Aim:To observe the effect of probucol on cardiomyocyte apoptosis induced by hydrogen peroxide(H2O2) and to explore its possible mechanisms.Methods:Cultured neonatal rat cardiomyocytes were randomly divided into 4 groups，and were given 0，1，10，and 100 μmol/L probucol pretreatment for 6 h，respectively，and then induced by 0.2 mmol/L H2O2for 6 h.Apoptosis cells were assessed by flow cytometry.The mRNA expression of Bcl-2 and Bax in cardiomyocytes was determined by RT-PCR.The superoxide dismutase(SOD)activity and malondialdehyde(MDA)contents in cells were tested by xanthine oxidase method and color reaction of thiobarbituric acid method，respectively.Results:Probucol decreased cardiomyocyte apoptosis induced by H2O2and Bax mRNA expression，increased Bcl-2 mRNA expression，increased SOD activity and decreased the MDA content significantly.All these effects were in a dose-dependent manner.Conclusion:Probucol could inhibit cardiomyocyte apoptosis induced by H2O2partly by reducing the oxidative stress level.

R972

*河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿項(xiàng)目資助課題 112300410049

(2011-02-11收稿 責(zé)任編輯王 曼)