李笑竹，趙貴森，岳陽陽，翟仙敦，艾紅偉，薛小琦

河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證學(xué)教研室洛陽 471003

#通訊作者，男，1972年12月生，博士，副教授，研究方向:分子遺傳學(xué)，E-mail:lyfy@mail.haust.edu.cn

Hela細(xì)胞雄激素受體基因外顯子1的甲基化檢測*

李笑竹，趙貴森#，岳陽陽，翟仙敦，艾紅偉，薛小琦

河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證學(xué)教研室洛陽 471003

#通訊作者，男，1972年12月生，博士，副教授，研究方向:分子遺傳學(xué)，E-mail:lyfy@mail.haust.edu.cn

雄激素受體;DNA甲基化;Hela細(xì)胞

目的:檢測Hela細(xì)胞雄激素受體(AR)基因外顯子1的甲基化水平。方法:用亞硫酸氫鹽克隆測序法和聯(lián)合亞硫酸氫鹽的限制酶法(COBRA)檢測不同來源Hela細(xì)胞AR基因外顯子1的甲基化水平，BiQ Analyzer軟件分析測序結(jié)果。結(jié)果:在非CpG胞嘧啶轉(zhuǎn)化率＞98%的前提下，Hela細(xì)胞AR基因外顯子1片段的總甲基化率≥96.2%，除第8個(gè)CpG位點(diǎn)外，其他CpG位點(diǎn)均為完全甲基化或高甲基化。COBRA法與測序法結(jié)果一致。結(jié)論: DNA甲基化可能是Hela細(xì)胞AR基因失活的分子機(jī)制。

Hela是一種感染HPV的宮頸癌細(xì)胞株，因?yàn)闆]有內(nèi)源性雄激素受體(androgen receptor，AR)表達(dá)，在激素研究中廣為應(yīng)用［1］。但Hela細(xì)胞AR失活的機(jī)制尚不清楚。有研究［2］表明，HPV感染的細(xì)胞易發(fā)生AR基因的甲基化。結(jié)合雄激素對女性生殖道上皮的抗增殖作用，作者推測AR甲基化可能參與了HPV相關(guān)宮頸癌的發(fā)病過程。該研究調(diào)查Hela細(xì)胞AR基因外顯子1的甲基化狀態(tài)，初步探討HPV相關(guān)宮頸癌細(xì)胞AR基因失活的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 不同來源的Hela細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫系、病理系，同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科研究室以及河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系分別提供。離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pBS-T PCR產(chǎn)物克隆試劑盒購自TIANGEN公司;低熔點(diǎn)瓊脂糖、亞硫酸氫鈉和對苯二酚購自Sigma公司;限制酶TaqⅠ和EcoR I購自TaKaRa公司;Acrylamide和Bis-acrylamide為Amresco公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 DNA的提取和修飾 取常規(guī)培養(yǎng)、處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，酚-氯仿法提取基因組DNA，紫外分光光度法定量。DNA的亞硫酸氫鹽修飾按照Olek等［3］的方法進(jìn)行:以低熔點(diǎn)瓊脂糖包被片段化的變性DNA，5 mol/L亞硫酸氫鈉50℃處理4 h，然后順次以不同的溶液浸泡DNA/瓊脂糖小珠達(dá)到脫鹽、脫磺基和純化的目的。

1.3 PCR反應(yīng) Bisulfite-PCR引物用在線軟件Methprimer設(shè)計(jì)，AR上游引物5’-GTTTAAGGATG GAAGTGTAGTTAGG-3’，下游引物 5’-CCACA AACTTAAAAAAAACCATCCT-3’，擴(kuò)增片段包含13個(gè) CpG位點(diǎn)，約 300bp(GenBank序列號AL049564)。PCR體系50 μL，含處理后的DNA/瓊脂糖小珠1個(gè)(約10 μL)，上、下游引物各15 pmol，0.2 mmol/L dNTP，1×PCR buffer，Taq DNA聚合酶1 U。循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min;94℃ 35 s、55℃40 s、72℃40 s，37個(gè)循環(huán);72℃ 延伸15 min。

1.4 甲基化分析 PCR產(chǎn)物電泳分離后回收目的條帶。一部分進(jìn)行T-A克隆、藍(lán)白篩選，鑒定出10個(gè)克隆在PE377循環(huán)儀上測序，按亞硫酸氫鹽克隆測序法(bisulfite genomic sequencing，BGS)進(jìn)行分析。另一部分用TaqⅠ和EcoRⅠ酶切，消化產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳，按聯(lián)合亞硫酸氫鹽的限制酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)進(jìn)行甲基化分析［4］。

1.5 序列數(shù)據(jù)分析 將每個(gè)克隆的測序結(jié)果去除載體和引物后以純文本格式保存，并與相應(yīng)的基因組序列文件放在同一目錄下。每個(gè)片段的序列資料組成獨(dú)立的數(shù)據(jù)庫。BiQ Analyzer軟件［5］調(diào)取數(shù)據(jù)分析，自動(dòng)報(bào)告每個(gè)克隆的轉(zhuǎn)化率、CpG甲基化狀態(tài)，并綜合同一片段所有克隆的信息生成甲基化譜。

2 結(jié)果

BGS法:每種來源的Hela細(xì)胞DNA測序10個(gè)克隆，結(jié)果均滿足BiQ Analyzer軟件的默認(rèn)分析標(biāo)準(zhǔn)。所有樣本總的和各個(gè)克隆的非CpG胞嘧啶轉(zhuǎn)化率均大于98%，Hela細(xì)胞AR基因外顯子1片段的總甲基化率≥96.2%(125/130)，除第8個(gè)CpG位點(diǎn)外，其他CpG位點(diǎn)都是完全甲基化或高甲基化;第8個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化程度用EcoRⅠ酶切法進(jìn)一步驗(yàn)證(圖1)。

COBRA法:Bisulfite-PCR產(chǎn)物(277 bp)可被TaqⅠ完全切斷，但只能被EcoRⅠ部分消化(圖2)，水解后的片段大小與預(yù)期一致(TaqⅠ:212 bp，65 bp;EcoRⅠ:164 bp，113 bp)。變換PCR參數(shù)不影響擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果。以不同來源的Hela細(xì)胞重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果總體不變。

圖1 BGS法甲基化分析圖譜

圖2 COBRA法甲基化分析圖譜

3 討論

AR基因外顯子1是啟動(dòng)子CpG島的一部分。作者用BGS法調(diào)查了其中13個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化情況，結(jié)果顯示多數(shù)CpG位點(diǎn)在測序的10個(gè)克隆中都是甲基化的，而不是正常女性細(xì)胞預(yù)期的半甲基化。用COBRA酶切法驗(yàn)證第4和第8個(gè)CpG位點(diǎn)，與測序結(jié)果一致，可以排除克隆偏性。變換PCR參數(shù)進(jìn)行COBRA實(shí)驗(yàn)，可以排除PCR偏性，即非甲基化模板優(yōu)勢擴(kuò)增導(dǎo)致樣品呈高甲基化的可能性［6］。以不同實(shí)驗(yàn)室保存的Hela細(xì)胞重復(fù)實(shí)驗(yàn)可以排除細(xì)胞來源問題。上述結(jié)果均支持Hela細(xì)胞AR基因外顯子1高度甲基化。

AR基因失活在生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。啟動(dòng)子CpG島甲基化是AR基因失活的機(jī)制之一［7-9］。但對宮頸癌組織AR基因的表達(dá)和甲基化情況目前尚缺乏研究。該研究結(jié)果顯示Hela細(xì)胞AR基因外顯子1存在高度甲基化現(xiàn)象，說明DNA甲基化可能是Hela細(xì)胞AR基因失活的分子機(jī)制，從而把HPV感染、AR基因失活、雄激素的抗增殖作用等事實(shí)聯(lián)系起來，為宮頸癌研究提供了一條新的線索。作者正在收集宮頸癌標(biāo)本，并對Hela細(xì)胞AR基因啟動(dòng)子的其他片段進(jìn)行甲基化分析，希望能進(jìn)一步證實(shí)AR基因甲基化與HPV感染和宮頸癌的關(guān)系，為HPV相關(guān)宮頸癌的防治提供新的思路。

［1］Benjamin CL，Jenster G，Piedrahita JA.Use of artificial androgen receptor coactivators to alter myoblast proliferation［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2004，91(3):111

［2］Liu L，Zhang J，Bates S，et al.A methylation profile of in vitro immortalized human cell lines［J］.Int J Oncol，2005，26(1):275

［3］ Olek A，Oswald J，Walter J.A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis［J］.Nucleic Acids Res，1996，24(24):5064

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［6］Grunau C，Clark SJ，Rosenthal A.Bisulfite genomic sequencing:systematic investigation of critical experimental parameters［J］.Nucleic Acids Res，2001，29(13):E65

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*廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研項(xiàng)目 Z2009259

Methylation analysis of androgen receptor exon-1 in Hela cells

LI Xiaozhu，ZHAO Guisen，YUE Yangyang，ZHAI Xiandun，AI Hongwei，XUE XiaoqiDepartment of Forensic Biological Evidence，School of Forensic Medicine，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003

androgen receptor;DNA methylation;Hela cell line

Aim:To investigate the methylation level of the androgen receptor(AR)exon-1 in Hela cells.Methods: Methylation analysis of the AR exon-1 was performed by bisulfite genomic sequencing(BGS)and combined bisulfite restriction analysis(COBRA).The sequencing data were analyzed by BiQ Analyzer.Results:At relatively high conversion rate (＞98%)，the methylation ratio of the AR exon-1 was still more than 96.2%.Except for the eighth CpG，all other CpGs under investigations were fully or highly methylated.The results of COBRA were in accordance with that of BGS.Conclusion:DNA methylation may involve in the inactivation of AR gene in Hela cells.

R737.3

*河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)基金資助項(xiàng)目 082102310097;河南科技大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目 2007QN013

(2011-03-03收稿 責(zé)任編輯徐春燕)