李俊平，劉 岷，毛麗紅，石 科，李 靚，許 堯，薛樂勛

鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鄭州 450001

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導師，研究方向:腫瘤標志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻FLA8基因全長的克隆及鑒定*

李俊平，劉 岷，毛麗紅，石 科，李 靚，許 堯，薛樂勛#

鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鄭州 450001

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導師，研究方向:腫瘤標志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻;FLA8基因;驅動蛋白-2

目的:獲得FLA8基因cDNA序列。方法:根據衣藻、小球藻等驅動蛋白-2亞基的氨基酸高度保守序列GYNGTIF、NEDPKDA設計一對簡并引物，采用RT-PCR及3’RACE和5’RACE的方法擴增杜氏鹽藻FLA8基因的全長。結果:克隆得到的杜氏鹽藻FLA8基因cDNA全長序列為2 612 bp，序列分析顯示其包括90 bp的5’UTR、167 bp的3’UTR以及2 355 bp的開放閱讀框，其編碼784個氨基酸殘基，蛋白質的理論等電點為6.65，相對分子質量為85 097。氨基酸序列同源性分析顯示其與其他物種有較高的同源性:團藻(98%)、衣藻(99%)、小球藻(92%)。結論:得到杜氏鹽藻驅動蛋白-2亞基FLA8的基因全長。

鞭毛/纖毛在感知和向細胞內傳遞外界環(huán)境信號的過程中擔任重要角色，多囊腎疾病、癌癥等多種發(fā)育異常均與纖毛缺陷相關［1］。近年來，以有鞭毛的低等生物作為模式生物來研究鞭毛/纖毛相關性疾病成為一個重要的研究方向［2］，但到目前為止，鞭毛長度的調控機制依然不清楚［3-4］。鞭毛的組裝由鞭毛內轉運(intraflagellar transport，IFT)調控，分別由正向運輸和逆向運輸完成，鞭毛內顆粒從基體沿著軸絲運輸到鞭毛頂部的正向運輸是通過驅動蛋白(kinesin-2)進行的，而由鞭毛頂端向基體的逆向運輸則通過動力蛋白(Dynein)進行。驅動蛋白作為一個正向末端的微管動力蛋白包括2個驅動蛋白亞基(FLA10，F(xiàn)LA8)和1個非動力結合亞基(KAP)3個亞單位［5-7］。目前對FLA8的功能研究相對較少。作者對杜氏鹽藻FLA8基因全長進行了克隆，為進一步研究FLA8在鞭毛運輸過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 杜氏鹽藻藻株UTEX-LB-1644購自美國得克薩斯州大學，載體 pMD19T-vector購自大連寶生物工程公司，大腸桿菌 DH5α為該室保存，EcoRⅠ、HindⅢ、LA Taq酶、rTaq酶、膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒均購自大連寶生物工程公司，反轉錄試劑盒購自Fermentas公司。

1.2 杜氏鹽藻cDNA的制備 按5×105mL－1的接種量將杜氏鹽藻細胞接種于改良的PKS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為26℃，光照強度為4 500 Lux，光/暗培養(yǎng)各12 h。取處于對數生長期的鹽藻細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計檢測所提取總 RNA的質量和濃度。取2 μg RNA作為模板，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄得cDNA，置于－20℃保存。

1.3 杜氏鹽藻FLA8基因部分序列的克隆及鑒定從GenBank上搜索已登錄的kinesin-2蛋白(KS2)的氨基酸序列進行比對，根據其在衣藻、小球藻等物種中的保守性找出兩段相對比較保守的序列設計簡并引物，KS2上游引物:5’-GGNTA(T/C)AA(T/C) GGNCANAT(T/C/A)TT-3’，下游引物:5’-GC(G/ A)TC(C/T)TTNGG(G/A)TC(C/T)TC(G/A)TT-3’，由上海博尚生物技術有限公司合成。以制備的cDNA為模板，利用合成的簡并引物PCR法擴增鹽藻細胞FLA8的部分基因序列。PCR反應體系:cDNA 1 μL，10×LA Buffer(Mg2+plus)10 μ L，dNTP Mixture(10 mmol/L)8 μL，上、下游引物(50 μmol/ L)各1 μL，LA Taq 1 μL，dH2O補至100 μ L。PCR反應程序:95℃5 min;94℃30 s，40～60℃30 s，72℃ 2 min，30個循環(huán);72℃ 10 min，4℃終止反應。PCR反應結束后，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。將PCR產物膠回收，與pMD19-T-vector連接，過夜并轉化至大腸桿菌 DH5α，用含有Ampr、IPTG和X-Gal的平板進行藍白斑篩選，挑取陽性菌落培養(yǎng)，提取質粒pMD-K1后經雙酶切鑒定。

1.4 杜氏鹽藻FLA8基因cDNA 3’端序列擴增

根據簡并引物擴增得到的已知序列，設計鹽藻FLA8的3’RACE引物(外側引物 K1:5’-GTC CAACCGCACCGTCTTAG-3’，內側引物 K2:5’-ACAAGGGATGGAAGATATACAGGA-3’);3’RACE試劑盒中自帶的引物序列如下:外側引物K3:5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACT-3’，內側引物K4:5’-CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTAT AGG-3’。提取對數期的杜氏鹽藻的總 RNA，按照First Choice RLM-RACE Kit說明進行操作。PCR反應程序:95℃5 min，94℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 3 min，30個循環(huán);72℃ 10 min，4℃終止反應。巢式PCR反應產物經10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，連接于pMD19-T-vector上，轉化至大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落培養(yǎng)，提取質粒pMD-K2后用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定。

1.5 杜氏鹽藻FLA8基因cDNA 5’端序列擴增根據簡并引物擴增得到的已知序列設計鹽藻FLA8 5’RACE引物鹽藻FLA8外側引物K2-1:5’-ACAC GAAGACTGTGATGGT-3’，內側引物FLA6:5’-CAG GCTGTCCAGTCATTGTG-3’;試劑盒自帶外側引物序列:外側引物為5’-CATGGCTACATGCTGACAGC CTA-3’，內側引物為5’-CGCGGATCCACAGCCTA CTGATGATCAGTCGATG-3’。按照TaKaRa公司的5’RACE說明書制備模板，設置反應條件和程序。巢式PCR反應產物經10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，連接于pMD19-T-vector上，轉化至大腸桿菌 DH5α，挑取陽性菌落培養(yǎng)，提取質粒pMD-K3后用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定。

1.6 杜氏鹽藻FLA8基因cDNA全長的克隆 根據所得到的3段cDNA序列，重新設計FLA8基因的特異性引物，然后用RT-PCR方法進行擴增獲得杜氏鹽藻FLA8基因的cDNA全長序列。設計的引物序列如下:FLA8F序列為5’-ATGAGCAGCGGAGC CAATCC-3’，F(xiàn)LA8R序列為 5’-TCATGCAGGCT TAGAAGAC-3’。以獲得的杜氏鹽藻cDNA為模板，以FLA8F、FLA8R為引物，擴增獲得杜氏鹽藻FLA8基因的cDNA全長。PCR反應程序:95℃5 min;94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán);72℃10 min，4℃終止反應。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，轉化并挑選陽性克隆，提取質粒pMD-K4，鑒定正確后測序并進行同源性分析。

2 結果

2.1 杜氏鹽藻總RNA的純度和質量鑒定 根據瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，所提取的杜氏鹽藻總RNA質量較好，無拖尾現(xiàn)象，28S與18S亮度比約為2∶1，且無RNA降解和DNA、蛋白質污染，可以用于下步實驗。

2.2 杜氏鹽藻FLA8基因部分序列的克隆及鑒定

見圖1。RT-PCR所得片段長度約為772 bp，與理論值相符。膠回收后pMD19-T-vector連接，提取質粒PK-1，用EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切，得一條載體片段和一條插入片段，插入片段與回收片段大小一致。

圖1 FLA8 RT-PCR及pMD-K1的酶切鑒定

2.3 杜氏鹽藻FLA8基因cDNA 3’RACE結果見圖2。3’RACE所得片段長度約為1 700 bp，膠回收后連接于 pMD19-T-vector，得質粒 pMD-K2，經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，得到一條載體片段和一條插入片段，插入片段與回收片段大小一致。

圖2 FLA8 3’RACE及pMD-K2的酶切鑒定

2.4 杜氏鹽藻FLA8基因cDNA 5’RACE結果見圖3。用EcoRⅠ和HindⅢ對pMD-K3質粒進行雙酶切鑒定，酶切后瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示插入片段與膠回收得到的片段大小是相符的。

圖3 FLA8基因5’RACE及pMD-K3的酶切鑒定

2.5 杜氏鹽藻FLA8基因cDNA全長的克隆及鑒定 見圖4。對杜氏鹽藻FLA8基因cDNA全長進行擴增，獲得一條長為2 612 bp的片段，其大小與理論值相符。膠回收后連接于pMD19-T-vector上，得到質粒pMD-K4，用HindⅢ和EcoRⅠ進行雙酶切鑒定，可見一條載體片段和一條插入片段，插入片段與回收片段大小一致。

2.6 FLA8序列同源性分析 序列分析顯示擴增片段包括90 bp的5’UTR、167 bp的3’UTR以及2 355 bp的開放閱讀框，其NCBI GenBank登錄號為JF825469，編碼784個氨基酸殘基，蛋白質的理論等電點為6.65，相對分子質量為85 097。該氨基酸序列與其他物種的FLA8氨基酸序列進行比對，Blast結果、DNAMAN軟件分析和進化樹分析結果顯示，與其他物種的FLA8氨基酸序列具有較高的同源性:團藻(98%)、衣藻(99%)、小球藻(92%)。

圖4 FLA8基因cDNA全長的PCR擴增及其酶切鑒定

3 討論

該研究所克隆的鹽藻FLA8氨基酸和衣藻、小球藻的FLA8的氨基酸同源性分別為99%、91%，和大鼠、人類的KIF3A的氨基酸同源性均為80%，說明該基因存在高度保守性，但由于物種不一樣，可能和其他物種存在差異性，提示可以利用鹽藻鞭毛來作為一種模式生物來研究。

FLA8序列已經在多種生物中被克隆出來，除了在鞭毛運輸及作為貨物被運輸的作用［8］外，它還有一些新作用正逐漸被發(fā)現(xiàn)。杜氏鹽藻是一種單細胞真核綠藻，其FLA8作為kinesin-2的一個動力亞基參與鞭毛的正向運輸外，其他功能尚不清楚。目前已有用基因敲除方法使物種缺失FLA8基因從而研究FLA8在鞭毛正向運輸中的作用，但是對于FLA8對鞭毛的其他功能尚不清楚，該研究為下一步研究FLA8基因在杜氏鹽藻鞭毛再生過程中的作用以及今后研究杜氏鹽藻FLA8蛋白的純化與結晶奠定了基礎。

［1］Veland IR，Awan A，Pedersen LB，et al.Primary cilia and signaling pathways in mammalian development，health and disease［J］.Nephron Physiol，2009，111(3):P39

［2］Snell WJ，Pan J，Wang Q.Cilia and flagella revealed: from flagellar assembly in Chlamydomonas to human obesity disorders［J］.Cell，2004，117(6):693

［3］ Pedersen LB，Rosenbaum JL.Intraflagellar transport( IFT)role in ciliary assembly，resorption and signalling［J］.Curr Top Dev Biol，2008，85:23

［4］閻赟夢，李慶華，李杰，等.杜氏鹽藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析［J］.鄭州大學學報:醫(yī)學版，2011，46(4):517

［5］Scholey JM.Intraflagellar transport motors in cilia:moving along the cell’s antenna［J］.J Cell Biol，2008，180(1):23

［6］Kondo S，Sato-Yoshitake R，Noda Y，et al.KIF3A is a new microtubule-based anterograde motor in the nerve axon［J］.J Cell Biol，1994，125(5):1095

［7］Scholey JM.Kinesin-Ⅱ，a membrane traffic motor in axons，axonemes，and spindles［J］.J Cell Biol，1996，133 (1):1

［8］Sharp DJ，Rogers GC，Scholey JM.Microtubue motors in mitosis［J］.Nature，2000，407(6800):41

Cloning and identification of the full-length cDNA sequence of FLA8 gene from Dunaliella salina

LI Junping，LIU Min，MAO Lihong，SHI Ke，LI Liang，XU Yao，XUE LexunLaboratory for Cell Biology，Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;FLA8;kinesin-2

Aim:To get the full-length cDNA sequence of FLA8 gene from Dunaliella salina(D.salina).Methods:A pair of degenerated primers was designed according to conserved homologous amino acid sequences of GYNGTIF and NEDPKDA of kinesin-2 motor subunit of FLA8 from microalgae and other organisms.The full-length cDNA of FLA8 gene was ob-tained by RT-PCR，3’and 5’RACE technology.Results:The results showed that the full-length cDNA sequence of the cloned FLA8 gene was 2 612 bp，possessing a 90 bp 5’UTR，a 167 bp 3’UTR and a 2 355 bp open reading frame encoding 784 amino acids.The theoretical pI value of FLA8 was 6.65 and the relative molecular weight was 85 097.Amino acid sequence homologous analysis indicated that FLA8 of D.salina shared high homology with other organisms，such as Volvox carteri f.nagariensis(98%)，Chlamydomonas reinhardtii(99%)，Micromonas(92%).Conclusion:The full-length cDNA sequence of FLA8 gene from D.salina has been cloned.

Q781

*國家自然科學基金資助項目 30700014;科技部國際科技合作基金資助項目 2007DFA01240

(2011-01-18收稿 責任編輯趙秋民)