許 芳，石 科，李 靚，張楠楠，薛樂勛

鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州 450001

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻FKBP cDNA的克隆及其在鞭毛解組裝中的功能*

許 芳，石 科，李 靚，張楠楠，薛樂勛#

鄭州大學(xué)生物工程系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州 450001

#通訊作者，男，1944年2月生，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤標(biāo)志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

杜氏鹽藻;FK506結(jié)合蛋白;鞭毛

目的:克隆杜氏鹽藻FK506結(jié)合蛋白(FKBP)的cDNA片段并探討其與鞭毛微管解組裝的聯(lián)系。方法:提取杜氏鹽藻總RNA，根據(jù)已知鹽藻FKBP cDNA 3’端序列，用5’RACE方法擴(kuò)增該cDNA的5’端序列，拼接得到全長并對其序列進(jìn)行分析。秋水仙堿處理對數(shù)生長期杜氏鹽藻，處理0、20、40、60、80、100、120、140和160 min后采用實(shí)時熒光定量PCR檢測FKBP mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果:經(jīng)5’RACE得到681 bp的FKBP cDNA片段，拼接后得到的cDNA全長1 075 bp，序列分析顯示其開放閱讀框?yàn)?62 bp，編碼253個氨基酸;經(jīng)BLAST比對，其氨基酸序列具有FKBP家族特有的功能結(jié)構(gòu)域，與萊茵衣藻、團(tuán)藻、小球藻、大麥及水稻的同源性分別為61%、54%、47%、48%和51%。杜氏鹽藻細(xì)胞FKBP mRNA表達(dá)量在秋水仙堿處理后20～40 min明顯升高，而在40～100 min時逐漸下降，但仍高于對照組(F組間=32.580，P＜0.001;F時間=5.543，P=0.001;F交互=237.306，P＜0.001)。結(jié)論:得到了杜氏鹽藻的FKBP cDNA全長序列;FKBP參與了杜氏鹽藻微管解組裝過程，可能參與了細(xì)胞通過鞭毛對外界應(yīng)激反應(yīng)的應(yīng)答。

1989年，Siekierka等［1］和Harding等［2］分別宣 布發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)，這種蛋白可以和免疫抑制劑他克莫司(FK506)結(jié)合，故將其命名為FK506結(jié)合蛋白(FK506 binding protein，F(xiàn)KBP)［3］。它們在原核生物與真核生物細(xì)胞中廣泛存在，是一類高度同源的受體類結(jié)合蛋白，具有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PPIase)活性，可以催化多肽或蛋白質(zhì)底物中的脯氨酸殘基N端肽鍵的構(gòu)象由順式轉(zhuǎn)為反式，從而影響其活性、磷酸化狀態(tài)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、亞細(xì)胞定位和穩(wěn)定性［3］。FK506或雷帕霉素可通過與 FKBP的結(jié)合，抑制mTOR信號通路的傳導(dǎo)，從而影響細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞運(yùn)動及代謝、細(xì)胞凋亡等過程［4］。鞭毛/纖毛是一種由細(xì)胞質(zhì)膜延伸的細(xì)胞表面突起，纖毛的異常能影響mTOR信號通路［5-6］。關(guān)于FKBP在mTOR中的作用研究很多，而其與鞭毛/纖毛的聯(lián)系還不清楚。杜氏鹽藻以其無細(xì)胞壁、有一對等長的鞭毛、生長周期短、培養(yǎng)條件簡單等獨(dú)特的優(yōu)勢可作為研究鞭毛的有力工具［7］。作者在已獲得的杜氏鹽藻FKBP cDNA 3’端序列的基礎(chǔ)上，用5’RACE方法得到杜氏鹽藻中的FKBP cDNA序列，并利用實(shí)時熒光定量PCR的方法檢測秋水仙堿處理后杜氏鹽藻細(xì)胞FKBP mRNA的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻株、菌株和載體 杜氏鹽藻和大腸桿菌DH5α均為該實(shí)驗(yàn)室保存，pMD19-T載體購自大連寶生物工程公司(TaKaRa)。

1.1.2 工具酶、主要試劑和儀器 5’-Full RACE

試劑盒，LA Taq DNA聚合酶，EcoRⅠ、HindⅢ 等DNA限制性內(nèi)切酶及IPTG均購自大連寶生物工程公司;膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量制備試劑盒購自AXYGEN公司，Trizol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，RealMasterMix(SYBR Green)購自天根生化科技(北京)有限公司;PCR特異性引物由上海生工生物工程有限公司合成; HPG400型光照培養(yǎng)箱購自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，紫外分光光度計(jì)為Thermo公司產(chǎn)品，7300實(shí)時熒光定量PCR儀購自System Applied Biosystems公司。

1.2 杜氏鹽藻總RNA的提取 接種杜氏鹽藻于UTEX-1644液體培養(yǎng)基，以26℃、光強(qiáng)4 500 Lux、明暗各12 h的條件培養(yǎng)。取對數(shù)生長期鹽藻細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)檢測，計(jì)算其A(260 nm)/A(280 nm)，判斷RNA的完整性和純度。產(chǎn)物保存于－80℃冰箱中。

1.3 杜氏鹽藻FKBP cDNA 5’端序列擴(kuò)增及拼接

根據(jù)已知的FKBP 3’端序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)5’RACE巢式PCR內(nèi)外側(cè)引物，并用DNAMAN分別檢測與5’RACE試劑盒中內(nèi)外側(cè)引物的互補(bǔ)性，以選用最合適的引物。5’RACE試劑盒自帶引物序列，外側(cè)引物:5’-CATGGCTACATGCTGA CAGCCTA-3’，內(nèi)側(cè)引物:5’-CGCGGATCCACAGC CTACTGATGATCAGTCGATG-3’。設(shè)計(jì)的FKBP引物序列，外側(cè)引物:5’-GCTTCAAACACCTTGGACAC-3’，內(nèi)側(cè)引物:5’-CGATTGGAGCCTTAGACAGC-3’。取杜氏鹽藻總RNA，按照5’-Full RACE試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為5’RACE模板。巢式PCR擴(kuò)增FKBP cDNA的5’端序列，PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠檢測，回收后與 pMD19-T載體連接(pMD19-T-5’FKBP)并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提質(zhì)粒，EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，隨機(jī)挑選3個送上海生工生物工程有限公司測序，對比所測得的序列，校正PCR過程中產(chǎn)生的堿基錯配，測序結(jié)果與已知序列進(jìn)行拼接。

1.4 秋水仙堿處理后杜氏鹽藻細(xì)胞FKBP表達(dá)情況分析 用Primer Premier 5.0在所得到的FKBP cDNA片段中設(shè)計(jì)一對特異性引物，并同時設(shè)計(jì)GAPDH基因特異性引物如下。FKBP上游引物:5’-TAGTTGGCTTAGGCTTGTGG-3’，下游引物:5’-TACCTTGCATTGCAGTTTTC-3’;GAPDH上游引物: 5’-CAAGTTCTCCGCCCGATGTGA-3’，下游引物:5’-GAACACGCCTGTGCCCTCAA-3’。離心收集300 mL處于對數(shù)生長期的鹽藻細(xì)胞，于2個相同的加有20 mL新培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中培養(yǎng)，一瓶按照每1 mL藻加入1 μL秋水仙堿(189 mmol/L)的標(biāo)準(zhǔn)向其中加入20 μL秋水仙堿溶液至終濃度為0.189 μmol/L作為實(shí)驗(yàn)組，另一瓶未經(jīng)處理的野生型藻株作為對照組。于處理20、40、60、80、100和120 min時分別取2組鹽藻，離心收集后加Trizol，勿混勻，保存于－80℃冰箱，共得到14個樣品。將取得的樣品分別用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，以GAPDH作為內(nèi)參。在進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR之前，先通過RT-PCR確定PCR最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，以避免實(shí)驗(yàn)過程中有引物二聚體等雜帶的產(chǎn)生。熒光PCR體系:cDNA 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，2.5×RealMaster-Mix/20×SYBR solution 11.25 μL，蒸餾水12.25 μL，共25 μL。熒光PCR程序:95℃4 min;94℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán);95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s。反應(yīng)結(jié)束之后根據(jù)2－ΔΔCT方法分析得到的數(shù)據(jù)。每個樣品均重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，秋水仙堿處理后2組FKBP mRNA表達(dá)水平的比較采用2×6析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 杜氏鹽藻總RNA質(zhì)量鑒定 瓊脂糖凝膠電泳顯示28S和18S亮度比例約為2∶1，無拖尾現(xiàn)象，說明RNA完整性較好，A(260 nm)/A(280 nm)介于1.8～2.0，無DNA和蛋白質(zhì)污染，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.25’RACE結(jié)果鑒定 經(jīng)5’RACE擴(kuò)增后得到一條約700 bp的條帶(圖1)，膠回收后與pMD19-T載體連接，雙酶切鑒定結(jié)果見圖2。經(jīng)測序、校正，最終確定得到了一個681 bp的序列。與已知序列拼接后得到的FKBP cDNA全長1 075 bp，其開放閱讀框762 bp，編碼253個氨基酸，BLAST結(jié)果顯示，推導(dǎo)得到的FKBP氨基酸序列具有FKBP家族所特有的結(jié)構(gòu)域，且與其他物種的FKBP氨基酸序列特別是藻類的FKBP有較高的同源性，與萊茵衣藻、團(tuán)藻、小球藻、大麥及水稻的同源性分別為61%、54%、47%、48%和51%。通過DNAMAN軟件對該序列分析得到FKBP蛋白的相關(guān)信息，其蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為27 037.08，等電點(diǎn)為8.6。

2.3 秋水仙堿處理后杜氏鹽藻細(xì)胞FKBP mRNA表達(dá)情況分析 秋水仙堿處理0～20 min，杜氏鹽藻細(xì)胞FKBP mRNA表達(dá)水平無變化，只是略高于對照組;20～40 min時升高，40～100 min逐漸降低，但仍高于對照組。見表1。

表1 秋水仙堿處理后杜氏鹽藻FKBP mRNA的相對表達(dá)量

3 討論

作者利用5’RACE方法擴(kuò)增得到的杜氏鹽藻FKBP cDNA全長1 075 bp，其中開放閱讀框762 bp，編碼253個氨基酸，DNAMAN軟件分析顯示，其相對分子質(zhì)量為27 037.08，等電點(diǎn)為8.6，經(jīng)BLAST比對，具有FKBP家族特有的結(jié)構(gòu)域且與其他物種尤其是藻類的FKBP有很高的同源性，如萊茵衣藻、團(tuán)藻、小球藻、大麥及水稻等。所以作者認(rèn)為得到的確實(shí)為杜氏鹽藻的FKBP序列。

FKBP蛋白廣泛存在于真核及原核生物中，除了參與調(diào)節(jié)激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，F(xiàn)KBP在植株的生長、種子的萌發(fā)、非生物脅迫及其抗逆性中起到重要作用［8］。鞭毛/纖毛是一種由細(xì)胞質(zhì)膜延伸的細(xì)胞表面突起，主要由微管組成［9］，纖毛蛋白的突變可導(dǎo)致發(fā)育缺陷，如多趾畸形、視網(wǎng)膜變性和多囊腎等［5，10-11］。多囊腎疾病中纖毛異常彎曲對于mTOR的下調(diào)是必需的，纖毛的缺失上調(diào)使腎臟肥大的信號通路而促進(jìn)了腎囊腫的形成［5-6］。秋水仙堿能阻止微管的形成，使杜氏鹽藻鞭毛縮短。作者根據(jù)得到的FKBP cDNA設(shè)計(jì)引物，采用實(shí)時熒光定量PCR的方法檢測杜氏鹽藻細(xì)胞在秋水仙堿破壞下FKBP mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，在秋水仙堿作用20～40 min，杜氏鹽藻細(xì)胞FKBP mRNA表達(dá)水平迅速升高，40～100 min時逐漸下降，但仍高于對照組，說明FKBP與鞭毛微管解組裝過程有關(guān)。FKBP參與了秋水仙素處理后杜氏鹽藻微管解組裝的過程，可能參與了杜氏鹽藻細(xì)胞通過鞭毛對外界應(yīng)激反應(yīng)的應(yīng)答，這為進(jìn)一步研究FKBP的功能提供了依據(jù)。

［1］Siekierka JJ，Staruch MJ，Hung SH，et al.FK-506，a potent novel immunosuppressive agent，binds to a cytosolic protein which is distinct from the cyclosporin A-binding protein cyclophilin［J］.J Immunol，1989，143(5):1580

［2］Harding MW，Galat A，Uehling DE，et al.A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase［J］.Nature，1989，341(6244):758

［3］Geisler M，Bailly A.Tête-à-tête:the function of FKBPs in plant development［J］.Trends Plant Sci，2007，12(10): 465

［4］陳洪菊，屈藝，母得志.mTOR信號通路的生物學(xué)功能［J］.生命的化學(xué)，2010，30(4):555

［5］Bell PD，F(xiàn)itzgibbon W，Sas K，et al.Loss of primary cilia upregulates renal hypertrophic signaling and promotes cystogenesis［J］.J Am Soc Nephrol，2011，22(5):839

［6］Boehlke C，Kotsis F，Patel V，et al.Primary cilia regulate mTORC1 activity and cell size through Lkb1［J］.Nat Cell Biol，2010，12(11):1115

［7］柳麗萍，李杰，王翠，等.杜氏鹽藻cDNA文庫的構(gòu)建及KCBP基因的克?。跩］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，45(6):907

［8］Nigam N，Singh A，Sahi C，et al.SUMO-conjugating enzyme(Sce)and FK506-binding protein(FKBP)encoding rice(Oryza sativa L.)genes:genome-wide analysis，expression studies and evidence for their involvement in abiotic stress response［J］.Mol Genet Genomics，2008，279 (4):371

［9］王翠，李杰，柳麗平，等.杜氏鹽藻寡糖基轉(zhuǎn)移酶亞基STT3a功能結(jié)構(gòu)域的克隆與表達(dá)分析［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2010，26(6):760

［10］Boletta A.Emerging evidence of a link between the polycystins and the mTOR pathways［J］.Pathogenetics，2009，2(1):6

［11］Cang BK，Hong Y，Dhe-Paganon S，et al.FKBP family proteins:immunophilins with versatile biological functions［J］.Neurosignals，2008，16(4):318

Cloning of FKBP cDNA from Dunaliella salina and analysis of its functions in flagellar disassembly

XU Fang，SHI Ke，LI Liang，ZHANG Nannan，XUE LexunLaboratory for Cell Biology，Department of Bioengineering，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

Dunaliella salina;FK506 binding protein;flagella

Aim:To clone the cDNA fragment of FK506 binding protein(FKBP)from Dunaliella salina(D.salina) and to investigate its function in the process of microtubule disassembly in flagella.Methods:The total RNA was extracted from D.salina and the full length of FKBP cDNA was amplified by 5’RACE method according to the known 3’terminal sequence.The expression of FKBP mRNA in D.salina treated with colchicine for 0，20，40，60，80，100，120，140 and 160 min，was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Results:A 681 bp DNA fragment was obtained by 5’RACE.The full length of FKBP cDNA was 1 075 bp long and contained an open reading frame of 762 bp which encodes 253 amino acids.Sequence analysis showed that it had the conserved domain of FKBP family and was homologous with Chlamydomonas reinhardtii(61%)，Volvox carteri f.nagariensis(54%)，Chlorella variabilis(47%)，Hordeum vulgare subsp.Vulgare (48%)and Oryza sativa Indica Group(51%).The expression of FKBP mRNA in D.salina 20～40 min after colchicine treatment significantly increased，and decreased gradually within 40～100 min after colchicine treatment，but still higher than the control(Fgroup=32.580，P＜0.001;Ftime=5.543，P=0.001;Finteraction=237.306，P＜0.001).Conclusion:The FKBP cDNA sequence of D.salina has been obtained successfully.The expression of FKBP has correlation with the process of microtubule disassembly in D.salina，and it may be involved in the response of the cells to external stress through the flagella.

Q781

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30700014;科技部國際科技合作基金資助項(xiàng)目 2007DFA01240

(2011-05-17收稿 責(zé)任編輯王 曼)